Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Toxoplasma gondii je intracelularni protozojski parazit koji modulira mikrookruženje inficiranog domaćina i poznato je da je povezan s incidencijom rasta tumora mozga.U ovoj studiji pretpostavljamo da egzosomalna miRNA-21 iz infekcije Toxoplasma potiče rast tumora mozga.Egzozomi iz BV2 mikroglije inficirane toksoplazmom su okarakterisani i potvrđena je internalizacija U87 ćelija glioma.Profili ekspresije egzosomalne mikroRNA analizirani su korištenjem nizova mikroRNA i mikroRNA-21A-5p povezanih sa Toxoplasma gondii i sortiranjem tumora.Također smo istraživali nivoe mRNA gena povezanih s tumorom u U87 glioma ćelijama mijenjajući nivoe miR-21 u egzosomima i učinak egzosoma na proliferaciju ljudskih U87 glioma stanica.U egzosomima ćelija glioma U87 inficiranih Toxoplasma gondii, ekspresija mikroRNA-21 je povećana, a aktivnost antitumorskih gena (FoxO1, PTEN i PDCD4) je smanjena.Egzozomi izvedeni iz BV2 inficirani toksoplazmom indukuju proliferaciju U87 ćelija glioma.Egzozomi induciraju rast ćelija U87 u modelu tumora miša.Predlažemo da povećani egzosomalni miR-21 u mikrogliji BV2 inficiranoj toksoplazmom može igrati važnu ulogu kao promotor rasta ćelija u U87 glioma ćelijama tako što smanjuje regulaciju antitumorskih gena.
Procjenjuje se da je više od 18,1 miliona slučajeva uznapredovalog karcinoma dijagnosticirano širom svijeta u 2018. godini, sa oko 297 000 dijagnostikovanih tumora centralnog nervnog sistema svake godine (1,6% svih tumora)1.Prethodna istraživanja su pokazala da faktori rizika za razvoj tumora ljudskog mozga uključuju različite hemijske proizvode, porodičnu anamnezu i jonizujuće zračenje iz terapijske i dijagnostičke opreme glave.Međutim, tačan uzrok ovih malignih bolesti nije poznat.Otprilike 20% svih karcinoma u svijetu uzrokovano je infektivnim agensima, uključujući viruse, bakterije i parazite3,4.Infektivni patogeni ometaju genetske mehanizme ćelije domaćina, kao što su popravak DNK i ćelijski ciklus, i mogu dovesti do hronične upale i oštećenja imunološkog sistema5.
Infektivni agensi povezani s ljudskim rakom najčešći su virusni patogeni, uključujući humane papiloma viruse i viruse hepatitisa B i C.Paraziti također mogu igrati potencijalnu ulogu u razvoju raka kod ljudi.Nekoliko vrsta parazita, a to su Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis i Hymenolepis nana, umiješane su u različite vrste raka kod ljudi 6,7,8.
Toxoplasma gondii je intracelularna protozoa koja reguliše mikrookruženje inficiranih ćelija domaćina.Procjenjuje se da ovaj parazit inficira oko 30% svjetske populacije, stavljajući cijelu populaciju u opasnost9,10.Toxoplasma gondii može inficirati vitalne organe, uključujući centralni nervni sistem (CNS), i uzrokovati ozbiljne bolesti kao što su fatalni meningitis i encefalitis, posebno kod imunokompromitovanih pacijenata9.Međutim, Toxoplasma gondii također može promijeniti okruženje zaraženog domaćina modulirajući rast stanica i imunološki odgovor kod imunokompetentnih pojedinaca, što dovodi do održavanja asimptomatske kronične infekcije9,11.Zanimljivo, s obzirom na korelaciju između prevalencije T. gondii i incidencije tumora na mozgu, neki izvještaji sugeriraju da in vivo promjene okoliša domaćina zbog kronične infekcije T. gondii liče na mikrookruženje tumora.
Egzozomi su poznati kao međućelijski komunikatori koji isporučuju biološki sadržaj, uključujući proteine ​​i nukleinske kiseline, iz susjednih stanica16,17.Egzozomi mogu utjecati na biološke procese povezane s tumorom, kao što su anti-apoptoza, angiogeneza i metastaze u mikrookruženju tumora.Konkretno, miRNA (miRNA), male nekodirajuće RNK dužine oko 22 nukleotida, važni su post-transkripcijski genski regulatori koji kontroliraju više od 30% ljudske mRNA kroz miRNA-induciran kompleks za utišavanje (miRISC).Toxoplasma gondii može poremetiti biološke procese kontroliranjem ekspresije miRNA u inficiranim domaćinima.MiRNA domaćina sadrže važne signale za regulaciju bioloških procesa domaćina kako bi se postigla strategija preživljavanja parazita.Stoga, proučavanje promjena u profilu miRNA domaćina nakon infekcije T. gondii može nam pomoći da jasnije razumijemo interakciju između domaćina i T. gondii.Zaista, Thirugnanam et al.15 sugeriraju da T. gondii promovira kancerogenezu mozga mijenjajući svoju ekspresiju na specifičnim miRNA domaćinima povezanim s rastom tumora i otkrili su da T. gondii može uzrokovati gliome kod eksperimentalnih životinja.
Ova studija se fokusira na promenu egzosomalnog miR-21 u mikrogliji domaćina inficiranoj Toxoplasma BV2.Uočili smo moguću ulogu izmijenjenog egzosomalnog miR-21 u rastu ćelija glioma U87 zbog zadržavanja u jezgru FoxO1/p27, koji je meta prekomjerno eksprimirane miR-21.
Egzozomi izvedeni iz BV2 dobijeni su diferencijalnim centrifugiranjem i potvrđeni različitim metodama kako bi se spriječila kontaminacija ćelijskim komponentama ili drugim vezikulama.SDS-poliakrilamid gel elektroforeza (SDS-PAGE) pokazala je različite obrasce između proteina ekstrahiranih iz BV2 ćelija i egzosoma (Slika 1A), a uzorci su procijenjeni na prisustvo Alixa, što je analizirano Western blotingom egzosomalnih proteinskih markera u .Alix obilježavanje je pronađeno u proteinima egzosoma, ali ne i u proteinima lizata BV2 ćelija (slika 1B).Dodatno, pročišćena RNK iz egzosoma izvedenih iz BV2 analizirana je bioanalizatorom.18S i 28S ribosomske podjedinice su rijetko uočene u obrascu migracije egzosomalne RNK, što ukazuje na pouzdanu čistoću (Slika 1C).Konačno, transmisiona elektronska mikroskopija je pokazala da su uočeni egzosomi bili veličine oko 60-150 nm i da su imali strukturu nalik čaši tipičnu za morfologiju egzosoma (slika 1D).
Karakterizacija egzosoma izvedenih iz BV2 ćelija.(A) Stranica sa sigurnosnim podacima.Proteini su izolovani iz BV2 ćelija ili egzosoma izvedenih iz BV2.Proteinski obrasci razlikuju se između stanica i egzosoma.(B) Western blot analiza egzosomalnog markera (Alix).(C) Evaluacija pročišćene RNK iz BV2 ćelija i egzosoma izvedenih iz BV2 pomoću bioanalizera.Dakle, 18S i 28S ribosomske podjedinice u BV2 ćelijama su rijetko pronađene u egzosomalnoj RNK.(D) Transmisiona elektronska mikroskopija je pokazala da su egzosomi izolovani iz BV2 ćelija negativno obojeni sa 2% uranil acetata.Egzozomi su veličine otprilike 60-150 nm i imaju oblik čaše (Song i Jung, neobjavljeni podaci).
Ćelijska internalizacija egzosoma izvedenih iz BV2 u ćelije humanog glioma U87 uočena je upotrebom konfokalne mikroskopije.PKH26 obilježeni egzosomi su lokalizirani u citoplazmi U87 stanica.Jezgra su obojena DAPI (slika 2A), što ukazuje da egzozomi izvedeni iz BV2 mogu biti internalizovani od strane ćelija domaćina i utiču na okruženje ćelija primaoca.
Internalizacija egzosoma izvedenih iz BV2 u ćelije glioma U87 i egzozoma izvedenih iz BV2 inficiranih Toxoplasma RH inducirala je proliferaciju U87 ćelija glioma.(A) Egzozomi obuhvaćeni ćelijama U87 mjereni konfokalnom mikroskopijom.Ćelije glioma U87 su inkubirane sa egzozomima označenim sa PKH26 (crveno) ili bez kontrole 24 sata.Jezgra su obojena DAPI (plavo) i zatim posmatrana pod konfokalnim mikroskopom (bar: 10 μm, x 3000).(B) Proliferacija ćelija glioma U87 određena je testom proliferacije ćelija.Ćelije glioma U87 tretirane su egzozomima za naznačeno vrijeme. *P < 0,05 dobijeno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobijeno je Studentovim t testom. *P < 0,05 polučeno po t-kriteriju Stjudenta. *P < 0,05 prema Studentovom t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, dobijen pomoću t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 dobijeno korišćenjem Studentovog t-testa.
Nakon što smo potvrdili internalizaciju egzosoma izvedenih iz BV2 u ćelije glioma U87, izvršili smo testove ćelijske proliferacije kako bismo istražili ulogu egzosoma izvedenih iz toksoplazme iz BV2 u razvoju ljudskih ćelija glioma.Tretman U87 ćelija egzozomima iz BV2 ćelija inficiranih T. gondii pokazao je da egzosomi izvedeni iz BV2 T. gondii uzrokuju značajno veću proliferaciju U87 ćelija u poređenju sa kontrolom (slika 2B).
Pored toga, rast ćelija U118 imao je iste rezultate kao i U87, pošto su egzosomi stimulisani toksoplazmom izazvali najviše nivoe proliferacije (podaci nisu prikazani).Na osnovu ovih podataka, možemo ukazati da egzosomi inficirani toksoplazmom iz BV2 imaju važnu ulogu u proliferaciji ćelija glioma.
Da bismo istražili učinak egzozoma inficiranih toksoplazmom na razvoj tumora, ubrizgali smo U87 gliomske ćelije u gole miševe za model ksenografta i ubrizgali egzozome izvedene iz BV2 ili egzozome iz BV2 inficirane s RH.Nakon što su tumori postali očigledni nakon 1 nedelje, svaka eksperimentalna grupa od 5 miševa je podeljena prema veličini tumora da bi se odredila ista početna tačka, a veličina tumora je merena 22 dana.
Kod miševa sa modelom ksenotransplantata U87, uočena je značajno veća veličina i težina tumora u grupi egzosoma inficiranih BV2 RH 22. dana (slika 3A,B).S druge strane, nije bilo značajne razlike u veličini tumora između grupe egzosoma izvedene iz BV2 i kontrolne grupe nakon tretmana egzosomom.Pored toga, miševi kojima su ubrizgane ćelije glioma i egzosomi vizualno su prikazali najveći volumen tumora u grupi egzosoma koji su dobijeni od BV2 inficiranih RH (slika 3C).Ovi rezultati pokazuju da egzosomi inficirani toksoplazmom izvedeni iz BV2 induciraju rast glioma u modelu tumora miša.
Onkogeneza (AC) egzosoma izvedenih iz BV2 u modelu miša s ksenograftom U87.Veličina tumora (A) i težina (B) su značajno povećane kod BALB/c golih miševa tretiranih egzozomima inficiranim RH koji potiču iz BV2.BALB/c golim miševima (C) je subkutano ubrizgano 1 x 107 U87 ćelija suspendovanih u Matrigel mešavini.Šest dana nakon injekcije, 100 μg egzosoma izvedenih iz BV2 tretirano je kod miševa.Veličina i težina tumora mjerene su u naznačenim danima i nakon žrtvovanja, respektivno. *P < 0,05. *P < 0,05. *R < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *R < 0,05. *P < 0,05.
Podaci su pokazali da je 37 miRNA (16 prekomjerno eksprimiranih i 21 smanjeno) povezanih s razvojem imuniteta ili tumora značajno izmijenjeno u mikroglijama nakon infekcije sojem Toxoplasma RH (slika 4A).Relativni nivoi ekspresije miR-21 među izmenjenim miRNA su potvrđeni RT-PCR u realnom vremenu u egzozomima izvedenim iz BV2, egzozomima tretiranim BV2 i U87 ćelijama.Ekspresija miR-21 pokazala je značajno povećanje egzozoma iz BV2 ćelija inficiranih Toxoplasma gondii (RH soj) (slika 4B).Relativni nivoi ekspresije miR-21 u BV2 i U87 ćelijama su se povećali nakon unosa izmenjenih egzosoma (slika 4B).Relativni nivoi ekspresije miR-21 u moždanim tkivima pacijenata sa tumorom i miševa inficiranih Toxoplasma gondii (ME49 soj) bili su viši nego u kontrolnoj grupi (slika 4C).Ovi rezultati koreliraju sa razlikama između nivoa ekspresije predviđenih i potvrđenih mikroRNA in vitro i in vivo.
Promjene u ekspresiji egzosomalnog miP-21a-5p u mikroglijama inficiranim Toxoplasma gondii (RH).(A) Pokazuje značajne promjene u siRNA povezane s imunitetom ili razvojem tumora nakon infekcije T. gondii RH.(B) Relativni nivoi ekspresije miR-21 detektovani su RT-PCR u realnom vremenu u egzozomima izvedenim od BV2, egzozomima tretiranim BV2 i ćelijama U87.(C) Relativni nivoi ekspresije miR-21 pronađeni su u tkivima mozga tumorskih pacijenata (N=3) i miševa inficiranih Toxoplasma gondii (ME49 soj) (N=3). *P < 0,05 dobijeno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobijeno je Studentovim t testom. *P < 0,05 je dobiveno pomoću t-kriterija Stjudenta. *P < 0,05 dobijeno je korišćenjem Studentovog t-testa. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, dobijen pomoću t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 dobijeno korišćenjem Studentovog t-testa.
Egzozomi iz RH-inficiranih BV2 ćelija doveli su do rasta glioma in vivo i in vitro (sl. 2, 3).Da bismo otkrili relevantne mRNA, ispitali smo nivoe mRNA antitumorskih ciljnih gena, viljuškarsku kutiju O1 (FoxO1), PTEN i programiranu ćelijsku smrt 4 (PDCD4) u U87 ćelijama inficiranim egzozomima izvedenim iz BV2 ili RH BV2.Bioinformatička analiza je pokazala da nekoliko gena povezanih s tumorom, uključujući gene FoxO1, PTEN i PDCD4, imaju miR-2121,22 vezna mjesta.Nivoi mRNA antitumorskih ciljnih gena smanjeni su u egzozomima inficiranim BV2 u poređenju sa egzozomima izvedenim iz BV2 (slika 5A).FoxO1 je pokazao smanjene nivoe proteina u egzozomima inficiranim BV2 u poređenju sa egzozomima izvedenim od BV2 (Slika 5B).Na osnovu ovih rezultata, mogli bismo potvrditi da egzosomi izvedeni iz RH-inficiranog BV2 smanjuju regulaciju antionkogenih gena, zadržavajući njihovu ulogu u rastu tumora.
Toxoplasma RH inficirani egzozomi BV2 indukuju supresiju antitumorskih gena u U87 glioma ćelijama egzozomima koji su inficirani Toxoplasma RH iz BV2.(A) PCR u realnom vremenu ekspresije FoxO1, PTEN i PDCD4 u egzozomima izvedenim iz T. gondii RH-inficiranog BV2 u poređenju sa egzozomima PBS.β-aktinska mRNA je korištena kao kontrola.(B) Ekspresija FoxO1 određena je Western blottingom i podaci denzitometrije su statistički procijenjeni korištenjem programa ImageJ. *P < 0,05 dobijeno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobijeno je Studentovim t testom. *P < 0,05 je dobiveno pomoću t-kriterija Stjudenta. *P < 0,05 dobijeno je korišćenjem Studentovog t-testa. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, dobijen pomoću t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 dobijeno korišćenjem Studentovog t-testa.
Da bi se razumio učinak miP-21 u egzosomima na regulaciju gena povezanu s tumorom, ćelije U87 su transficirane inhibitorom miP-21 pomoću Lipofectamine 2000, a ćelije su sakupljene 24 sata nakon transfekcije.Nivoi ekspresije FoxO1 i p27 u ćelijama transficiranim miR-21 inhibitorima su upoređeni sa ćelijama tretiranim egzozomima izvedenim iz BV2 korišćenjem qRT-PCR (slika 6A,B).Transfekcija miR-21 inhibitora u ćelije U87 značajno je smanjila ekspresiju FoxO1 i p27 (slika 6).
RH-inficirani egzosomalni miP-21 izveden iz BV2 izmijenio je ekspresiju FoxO1/p27 u U87 ćelijama glioma.U87 ćelije su transficirane miP-21 inhibitorom upotrebom Lipofectamine 2000, a ćelije su sakupljene 24 sata nakon transfekcije.Nivoi ekspresije FoxO1 i p27 u ćelijama transficiranim miR-21 inhibitorima su upoređeni sa nivoima u ćelijama tretiranim egzozomima izvedenim iz BV2 pomoću qRT-PCR (A, B).
Da bi izbjegao imunološki odgovor domaćina, parazit Toxoplasma se pretvara u tkivnu cistu.Oni parazitiraju na različitim tkivima, uključujući mozak, srce i skeletne mišiće, tokom života domaćina i moduliraju imuni odgovor domaćina.Osim toga, mogu regulisati ćelijski ciklus i apoptozu ćelija domaćina, promovišući njihovu proliferaciju14,24.Toxoplasma gondii pretežno inficira dendritske ćelije domaćina, neutrofile i lozu monocita/makrofaga, uključujući mikrogliju mozga.Toxoplasma gondii inducira diferencijaciju makrofaga M2 fenotipa, utiče na zarastanje rana nakon infekcije patogenom, a takođe je povezana sa hipervaskularizacijom i granulomatoznom fibrozom.Ova bihejvioralna patogeneza infekcije Toxoplasma može biti povezana s markerima povezanim s razvojem tumora.Neprijateljsko okruženje koje reguliše toksoplazma može ličiti na odgovarajući prekancerom.Stoga se može pretpostaviti da infekcija Toxoplasma treba da doprinese razvoju tumora mozga.U stvari, zabilježene su visoke stope infekcije toksoplazmom u serumu pacijenata s različitim tumorima mozga.Osim toga, Toxoplasma gondii može biti još jedan karcinogeni efektor i djeluje sinergistički kako bi pomogao drugim infektivnim kancerogenima da razviju tumore mozga.S tim u vezi, vrijedno je napomenuti da P. falciparum i Epstein-Barr virus sinergijski doprinose nastanku Burkittovog limfoma.
Uloga egzosoma kao regulatora u polju istraživanja raka je opširno istražena.Međutim, uloga egzosoma između parazita i inficiranih domaćina ostaje slabo shvaćena.Do sada su različiti regulatori, uključujući izlučene proteine, objasnili biološke procese pomoću kojih se protozojski paraziti odupiru napadu domaćina i održavaju infekciju.Nedavno je sve veći koncept da mikrovezikule povezane s protozoama i njihove mikroRNA u interakciji sa stanicama domaćinima stvaraju povoljno okruženje za njihov opstanak.Stoga su potrebne daljnje studije kako bi se otkrila veza između izmijenjenih egzosomalnih miRNA i proliferacije ćelija glioma.Promjena mikroRNA (klaster geni miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 i miR-17-92) se vezuje za STAT3 promotor u ljudskim makrofagima inficiranim toksoplazmom, regulira se i inducira anti -apoptoza kao odgovor na infekciju Toxoplasma gondii 29 .Infekcija toksoplazmom povećava ekspresiju miR-17-5p i miR-106b-5p, koji su povezani sa nekoliko hiperproliferativnih bolesti 30 .Ovi podaci sugeriraju da su miRNA domaćina regulirane infekcijom Toxoplasma važni molekuli za preživljavanje parazita i patogenezu u biološkom ponašanju domaćina.
Promijenjene miRNA mogu utjecati na različite tipove ponašanja tijekom inicijacije i progresije malignih stanica, uključujući gliome: samodovoljnost signala rasta, neosjetljivost na signale koji inhibiraju rast, izbjegavanje apoptoze, neograničeni replikativni potencijal, angiogenezu, invaziju i metastazu i upalu.Kod glioma, izmijenjene miRNA su identificirane u nekoliko studija profiliranja ekspresije.
U ovoj studiji, potvrdili smo visok nivo ekspresije miRNA-21 u ćelijama domaćinima inficiranim toksoplazmom.miR-21 je identificiran kao jedna od najčešće prekomjerno eksprimiranih mikroRNA u solidnim tumorima, uključujući gliome, 33 i njegova ekspresija je u korelaciji sa stupnjem glioma.Akumulirani dokazi sugeriraju da je miR-21 novi onkogen koji djeluje kao anti-apoptotički faktor u rastu glioma i visoko je eksprimiran u tkivima i plazmi malignih tumora ljudskog mozga.Zanimljivo je da inaktivacija miR-21 u ćelijama i tkivima glioma izaziva inhibiciju proliferacije ćelija zbog apoptoze zavisne od kaspaze.Bioinformatička analiza predviđenih ciljeva miR-21 otkrila je više gena supresora tumora povezanih sa putevima apoptoze, uključujući programiranu ćelijsku smrt 4 (PDCD4), tropomiozin (TPM1), PTEN i kutiju za glavu O1 (FoxO1), sa mjestom vezivanja miR-2121..22.38.
FoxO1, kao jedan od faktora transkripcije (FoxO), je uključen u razvoj različitih tipova humanog karcinoma i može regulisati ekspresiju gena supresora tumora kao što su p21, p27, Bim i FasL40.FoxO1 može da veže i aktivira inhibitore ćelijskog ciklusa kao što je p27 da bi suzbio rast ćelija.Štaviše, FoxO1 je ključni efektor PI3K/Akt signalizacije i reguliše mnoge biološke procese kao što su progresija ćelijskog ciklusa i diferencijacija ćelija kroz aktivaciju transkripcije p2742.
Zaključno, vjerujemo da egzosomalni miR-21 izveden iz mikroglije inficirane toksoplazmom može igrati važnu ulogu kao regulator rasta ćelija glioma (slika 7).Međutim, potrebne su daljnje studije kako bi se pronašla direktna veza između egzosomalnog miR-21, izmijenjene infekcije toksoplazmom i rasta glioma.Očekuje se da će ovi rezultati pružiti polaznu tačku za proučavanje veze između infekcije toksoplazmom i učestalosti glioma.
U ovoj studiji predlaže se šematski dijagram mehanizma karcinogeneze glioma (možda).Autor crta u programu PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Svi eksperimentalni protokoli u ovoj studiji, uključujući upotrebu životinja, bili su u skladu sa Standardnim etičkim smjernicama za brigu o životinjama i korisničkim komitetima Nacionalnog univerziteta u Seulu i odobreni su od strane Institucionalnog odbora za reviziju Medicinskog fakulteta Nacionalnog univerziteta u Seulu (IRB broj SNU- 150715).-2).Svi eksperimentalni postupci izvedeni su u skladu sa preporukama ARRIVE.
BV2 mišja mikroglija i U87 ćelije humanog glioma uzgajane su u Dulbecco-ovom modificiranom orlovom mediju (DMEM; Welgene, Seul, Koreja) i mediju Memorijalnog instituta Roswell Park (RPMI; Welgene), respektivno, od kojih svaka sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, l-4 m glutamin, 0,2 mM penicilina i 0,05 mM streptomicina.Ćelije su uzgajane u inkubatoru sa 5% CO2 na 37°C.Druga ćelijska linija glioma, U118, korištena je za poređenje sa ćelijama U87.
Da bi se izolovali egzosomi iz sojeva RH i ME49 inficiranih T. gondii, T. gondii tahizoiti (RH soj) su sakupljeni iz trbušne šupljine 6-nedjeljnih BALB/c miševa koji su ubrizgani 3-4 dana prije.Tahizoiti su isprani tri puta sa PBS i prečišćeni centrifugiranjem u 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Da bi se dobili tahizoiti soja ME49, BALB/c miševima je intraperitonealno ubrizgano 20 tkivnih cista, a transformacija tahizoita u ciste prikupljena je ispiranjem trbušne šupljine 6-8 dana nakon infekcije (PI).Miševi inficirani PBS-om.ME49 tahizoiti su uzgajani u ćelijama sa dodatkom 100 μg/ml penicilina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, SAD), 100 μg/ml streptomicina (Gibco/BRL) i 5% fetalnog goveđeg seruma (Lonza, Walkersville, MD) .., SAD) na 37 °C i 5% ugljičnog dioksida.Nakon kultivacije u Vero ćelijama, ME49 tahizoiti su dva puta propušteni kroz iglu od 25, a zatim kroz filter od 5 µm da bi se uklonili ostaci i ćelije.Nakon ispiranja, tahizoiti su resuspendirani u PBS44.Ciste tkiva Toxoplasma gondii soja ME49 održavane su intraperitonealnom injekcijom cista izolovanih iz mozga inficiranih C57BL/6 miševa (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Koreja).Mozak miševa inficiranih ME49 je sakupljen nakon 3 mjeseca PI i usitnjen pod mikroskopom kako bi se izolirale ciste.Zaraženi miševi su držani u posebnim uslovima bez patogena (SPF) na Medicinskom fakultetu Nacionalnog univerziteta u Seulu.
Ukupna RNK je ekstrahirana iz egzozoma izvedenih iz BV2, BV2 ćelija i tkiva koristeći miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema uputama proizvođača, uključujući vrijeme inkubacije za korak eluiranja.Koncentracija RNK je određena na spektrofotometru NanoDrop 2000.Kvalitet RNA mikroniza je procenjen korišćenjem Agilent 2100 bioanalizera (Agilent Technologies, Amstelveen, Holandija).
DMEM sa 10% FBS siromašnim egzozomima pripremljen je ultracentrifugiranjem na 100.000 g tokom 16 sati na 4°C i filtriran kroz filter od 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2 ćelije, 5 × 105, uzgajane su u DMEM-u koji sadrži 10% FBS sa osiromašenim egzozomima i 1% antibiotika na 37°C i 5% CO2.Nakon 24 sata inkubacije, ćelijama su dodani tahizoiti soja RH ili ME49 (MOI = 10), a neinvazivni paraziti su uklonjeni u roku od sat vremena i ponovo napunjeni DMEM.Egzozomi iz BV2 ćelija izolovani su modifikovanim diferencijalnim centrifugiranjem, najšire korišćenom metodom.Resuspendirajte pelet egzosoma u 300 µl PBS za analizu RNK ili proteina.Koncentracija izolovanih egzosoma određena je pomoću kompleta za analizu proteina BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) i spektrofotometra NanoDrop 2000.
Precipitati iz BV2 ćelija ili egzosomi izvedeni iz BV2 su lizirani u PRO-PREP™ rastvoru za ekstrakciju proteina (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Koreja) i proteini su stavljeni na Coomassie briljantno plavo obojene 10% SDS poliakrilamidne gelove.Dodatno, proteini su prebačeni na PVDF membrane tokom 2 sata.Western blotovi su validirani korištenjem Alix antitijela (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, SAD) kao egzosomalnog markera.HRP-konjugirani kozji anti-mišji IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, SAD) i LAS-1000 plus luminescentni analizator slike (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) korišteni su kao sekundarno antitijelo..Za proučavanje veličine i morfologije egzosoma urađena je transmisiona elektronska mikroskopija.Egzozomi izolovani iz BV2 ćelija (6,40 µg/µl) pripremljeni su na mrežicama obloženim ugljenikom i negativno obojeni sa 2% uranil acetata 1 min.Pripremljeni uzorci su posmatrani na ubrzavajućem naponu od 80 kV pomoću JEOL 1200-EX II (Tokio, Japan) opremljenog ES1000W Erlangshen CCD kamerom (Gatan, Pleasanton, Kalifornija, SAD).
Egzozomi izvedeni iz BV2 obojeni su pomoću PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) 15 minuta na sobnoj temperaturi.U87 ćelije, 2×105, sa egzozomima obeleženim PKH26 (crveno) ili bez egzozoma kao negativna kontrola, inkubirane su na 37°C tokom 24 sata u inkubatoru sa 5% CO2.Ćelijska jezgra U87 su obojena DAPI (plavo), U87 ćelije su fiksirane u 4% paraformaldehidu 15 minuta na 4°C i zatim analizirane u Leica TCS SP8 STED CW konfokalnom mikroskopskom sistemu (Leica Microsystems, Mannheim, Njemačka).vidljivo.
cDNA je sintetizirana iz siRNA korištenjem Mir-X siRNA sinteze prvog lanca i SYBR qRT-PCR kita (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Kvantitativni PCR u realnom vremenu je izveden korišćenjem iQ5 PCR sistema za detekciju u realnom vremenu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) korišćenjem prajmera i šablona pomešanih sa SYBR Premixom.DNK je amplificirana za 40 ciklusa denaturacije na 95°C tokom 15 s i žarenja na 60°C tokom 60 s.Podaci iz svake PCR reakcije analizirani su pomoću modula za analizu podataka softvera optičkog sistema iQ™5 (Bio-Rad).Relativne promjene u ekspresiji gena između odabranih ciljnih gena i β-aktina/siRNA (i U6) izračunate su metodom standardne krive.Korištene sekvence prajmera prikazane su u tabeli 1.
3 x 104 U87 glioma ćelije su posađene u ploče sa 96 jažica i pomešane sa egzozomima inficiranim toksoplazmom izvedenim iz BV2 (50 μg/mL) ili nepulsnim egzozomima izvedenim iz BV2 (50 μg/mL) kao kontrole u 12, 18 sati .Brzina proliferacije ćelija određena je pomoću kompleta za brojanje ćelija-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (dodatne slike S1-S3) 46 .
Ženke BALB/c golih miševa stare 5 sedmica kupljene su od Orient Bio (Seongnam-si, Južna Koreja) i držane pojedinačno u sterilnim kavezima na sobnoj temperaturi (22±2°C) i vlažnosti (45±15°C).%) na sobnoj temperaturi (22±2°C) i vlažnosti (45±15%).12-satni ciklus svjetla i 12-satni ciklus tame izvedeni su pod SPF-om (Animal Center National University School of Medicine u Seulu).Miševi su nasumično podijeljeni u tri grupe od po 5 miševa i svim grupama je subkutano ubrizgano 400 ml PBS-a koji je sadržavao 1 x 107 U87 ćelija glioma i smanjen faktor rasta BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, SAD).Šest dana nakon injekcije tumora, 200 mg egzosoma izvedenih iz BV2 ćelija (sa/bez infekcije Toxoplasma) je ubrizgano na mjesto tumora.Dvadeset dva dana nakon infekcije tumorom, veličina tumora miševa u svakoj grupi je mjerena kaliperom tri puta sedmično, a zapremina tumora je izračunata po formuli: 0,5×(širina)×2×dužina.
Analiza ekspresije mikroRNA korištenjem miRCURYTM LNA miRNA niza, 7. generacije has, mmu i rno nizova (EXIQON, Vedbaek, Danska) koji pokrivaju 1119 dobro okarakteriziranih miševa među 3100 sondi za hvatanje miRNA ljudi, miša i pacova.Tokom ove procedure, 250 do 1000 ng ukupne RNK je uklonjeno iz 5′-fosfata tretmanom sa alkalnom fosfatazom u crevima teleta, nakon čega je sledilo obeležavanje Hy3 zelenom fluorescentnom bojom.Obilježeni uzorci su zatim hibridizirani umetanjem mikromreža pomoću kompleta za hibridizaciju komore (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD) i kompleta za hibridizaciju dijapozitiva (Agilent Technologies).Hibridizacija je vršena 16 sati na 56°C, a zatim su mikronizovi isprani u skladu sa preporukama proizvođača.Obrađeni slajdovi mikromreža su zatim skenirani pomoću Agilent G2565CA sistema mikromrežnih skenera (Agilent Technologies).Skenirane slike su uvezene pomoću softvera Agilent Feature Extraction verzije 10.7.3.1 (Agilent Technologies), a intenzitet fluorescencije svake slike je kvantificiran korištenjem odgovarajuće GAL datoteke modificiranog Exiqon protokola.Podaci o mikromrežu za trenutnu studiju pohranjeni su u GEO bazi podataka pod pristupnim brojem GPL32397.
Profili ekspresije zrelih egzosomalnih miRNA u mikroglijama sojeva RH ili ME49 inficiranih toksoplazmom analizirani su korištenjem različitih mrežnih alata.miRNA povezane sa razvojem tumora identifikovane su korišćenjem miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) i filtrirane sa normalizovanim intenzitetom signala (log2) većim od 8,0.Među miRNA, utvrđeno je da su različito eksprimirane miRNA više od 1,5 puta izmijenjene analizom filtera miRNA izmijenjenih sojevima RH ili ME49 inficiranim T. gondii.
Ćelije su zasijane u ploče sa šest jažica (3 x 105 ćelija/jažici) u opti-MEM (Gibco, Carlsbad, Kalifornija, SAD) upotrebom Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Transficirane ćelije su kultivisane 6 sati, a zatim je podloga promenjena u svežu potpunu podlogu.Ćelije su sakupljene 24 sata nakon transfekcije.
Statistička analiza je uglavnom vršena korišćenjem Studentovog t-testa sa Excel softverom (Microsoft, Washington, DC, USA).Za eksperimentalnu analizu na životinjama, obavljena je dvosmjerna ANOVA pomoću softvera Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornija, SAD). P-vrijednosti < 0,05 smatrane su statistički značajnim. P-vrijednosti < 0,05 smatrane su statistički značajnim. Značeniâ P <0,05 smatralisʹ statističeski značajnymi. P vrijednosti <0,05 smatrane su statistički značajnim. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Značeniâ P <0,05 smatralisʹ statističeski značajnymi. P vrijednosti <0,05 smatrane su statistički značajnim.
Sve eksperimentalne protokole korištene u ovoj studiji odobrio je Institucionalni odbor za reviziju Medicinskog fakulteta Nacionalnog univerziteta u Seulu (IRB broj SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Procijenjena globalna incidencija i smrtnost od raka u 2018: GLOBOCAN izvori i metode.Interpretacija.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Uvid u faktore rizika tumora mozga i njihove terapijske intervencije. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Uvid u faktore rizika tumora mozga i njihove terapijske intervencije.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Pregled faktora rizika za tumore mozga i glavne terapijske intervencije. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Duboko razumijevanje faktora rizika od tumora mozga i terapijskih intervencija.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Pregled faktora rizika za tumore mozga i glavne terapijske intervencije.Biomedicinska nauka.Farmaceut.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijsko-virusne interakcije kod karcinoma orodigestivnog i ženskog genitalnog trakta kod ljudi: sažetak epidemioloških i laboratorijskih dokaza. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijsko-virusne interakcije kod karcinoma orodigestivnog i ženskog genitalnog trakta kod ljudi: sažetak epidemioloških i laboratorijskih dokaza.Kato I., Zhang J. i Sun J. Bakterijsko-virusne interakcije u karcinomu ljudskog gastrointestinalnog trakta i ženskog genitalnog trakta: sažetak epidemioloških i laboratorijskih podataka. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriovirusna interakcija u probavi ljudske usne šupljine i ženskom reproduktivnom traktu: sažetak nauke o popularnim bolestima i laboratorijskih dokaza.Kato I., Zhang J. i Sun J. Bakterijsko-virusne interakcije u humanom gastrointestinalnom karcinomu i karcinomu ženskih genitalnih organa: sažetak epidemioloških i laboratorijskih podataka.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Od infekcije do raka: Kako DNK tumorski virusi mijenjaju centralni metabolizam ugljika i lipida ćelije domaćina. Magon, KL & Parish, JL Od infekcije do raka: Kako DNK tumorski virusi mijenjaju centralni metabolizam ugljika i lipida ćelije domaćina.Mahon, KL i Parish, JL Infekcija od požara do raka: kako tumorski virusi zasnovani na DNK mijenjaju centralni metabolizam ugljika i lipida ćelije domaćina. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代肿 Magon, KL & Parish, JL Od infekcije do raka: kako DNK tumorski virusi mijenjaju centralni metabolizam ugljika i lipida ćelije domaćina.Mahon, KL i Parish, JL izazivaju infekciju do raka: kako DNK tumorski virusi mijenjaju centralni metabolizam ugljika i lipida u stanicama domaćina.Otvorena biologija.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Katehol estrogeni šistosoma i jetrenih metilja i raka povezanih s helmintima.front.vruće unutra.5, 444 (2014).