Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Genski vektori za liječenje plućne cistične fibroze moraju biti usmjereni na provodne disajne puteve, budući da periferna plućna transdukcija nema terapeutski učinak.Efikasnost virusne transdukcije direktno je povezana sa vremenom boravka nosioca.Međutim, tekućine za isporuku kao što su nosači gena prirodno difundiraju u alveole tokom inhalacije, a terapeutske čestice bilo kojeg oblika brzo se uklanjaju mukocilijarnim transportom.Produženje vremena boravka nosilaca gena u respiratornom traktu je važno, ali je teško postići.Magnetne čestice konjugirane s nosačem koje se mogu usmjeriti na površinu respiratornog trakta mogu poboljšati regionalno ciljanje.Zbog problema sa in vivo snimanjem, ponašanje tako malih magnetnih čestica na površini disajnih puteva u prisustvu primijenjenog magnetnog polja je slabo shvaćeno.Cilj ovog istraživanja bio je korištenje sinhrotronskog snimanja za vizualizaciju in vivo kretanja niza magnetnih čestica u dušniku anesteziranih pacova kako bi se proučavala dinamika i obrasci ponašanja pojedinačnih i rasutih čestica in vivo.Zatim smo takođe procenili da li bi isporuka lentivirusnih magnetnih čestica u prisustvu magnetnog polja povećala efikasnost transdukcije u traheji pacova.Sinhrotronsko rendgensko snimanje pokazuje ponašanje magnetnih čestica u stacionarnim i pokretnim magnetnim poljima in vitro i in vivo.Čestice se ne mogu lako povući po površini živih disajnih puteva pomoću magneta, ali se tokom transporta naslage koncentrišu u vidnom polju, gdje je magnetsko polje najjače.Efikasnost transdukcije je takođe povećana šest puta kada su lentivirusne magnetne čestice isporučene u prisustvu magnetnog polja.Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da lentivirusne magnetne čestice i magnetna polja mogu biti vrijedni pristupi za poboljšanje ciljanja genskih vektora i nivoa transdukcije u provodnim disajnim putevima in vivo.
Cistična fibroza (CF) je uzrokovana varijacijama u jednom genu koji se zove CF transmembranski regulator provodljivosti (CFTR).CFTR protein je jonski kanal koji je prisutan u mnogim epitelnim ćelijama u cijelom tijelu, uključujući disajne puteve, glavno mjesto u patogenezi cistične fibroze.Defekti u CFTR dovode do abnormalnog transporta vode, dehidracije površine disajnih puteva i smanjene dubine površinskog sloja tečnosti disajnih puteva (ASL).Takođe narušava sposobnost sistema mukocilijarnog transporta (MCT) da očisti disajne puteve od udahnutih čestica i patogena.Naš cilj je da razvijemo lentivirusnu (LV) gensku terapiju za isporuku ispravne kopije CFTR gena i poboljšanje ASL, MCT i zdravlje pluća, te da nastavimo s razvojem novih tehnologija koje mogu mjeriti ove parametre in vivo1.
Vektori LV jedni su od vodećih kandidata za gensku terapiju cistične fibroze, uglavnom zato što mogu trajno integrirati terapeutski gen u bazalne stanice dišnih puteva (matične stanice disajnih puteva).Ovo je važno jer mogu vratiti normalnu hidrataciju i klirens sluzi diferenciranjem u funkcionalne gensko korigirane površinske ćelije dišnih puteva povezane s cističnom fibrozom, što rezultira doživotnim dobrobitima.Vektori LV moraju biti usmjereni protiv provodnih disajnih puteva, jer tu počinje zahvaćenost pluća u CF.Dostavljanje vektora dublje u pluća može rezultirati alveolarnom transdukcijom, ali to nema terapeutski učinak kod cistične fibroze.Međutim, tečnosti kao što su nosioci gena prirodno migriraju u alveole kada se udahnu nakon porođaja3,4 i terapeutske čestice se brzo izbacuju u usnu šupljinu pomoću MCT-a.Efikasnost LV transdukcije je direktno povezana sa dužinom vremena u kojem vektor ostaje blizu ciljnih ćelija kako bi omogućio ćelijski unos – “vrijeme boravka” 5 koje se lako skraćuje tipičnim regionalnim protokom zraka, kao i koordiniranim unosom sluzi i MCT čestica.Za cističnu fibrozu, sposobnost produženja vremena zadržavanja LV u disajnim putevima je važna za postizanje visokog nivoa transdukcije u ovoj oblasti, ali je do sada bila izazovna.
Da bismo prevazišli ovu prepreku, predlažemo da LV magnetne čestice (MP) mogu pomoći na dva komplementarna načina.Prvo, oni mogu biti vođeni magnetom do površine dišnih puteva kako bi se poboljšalo ciljanje i pomoglo česticama nosača gena da budu u pravom području dišnog puta;i ASL) prelaze u ćelijski sloj 6. MP se naširoko koriste kao ciljana sredstva za isporuku lijekova kada se vežu na antitijela, lijekove za kemoterapiju ili druge male molekule koji se vežu na ćelijske membrane ili se vezuju za odgovarajuće receptore ćelijske površine i akumuliraju se na mjestima tumora u prisustvo statičkog elektriciteta.Magnetna polja za terapiju raka 7. Druge “hipertermične” metode imaju za cilj ubijanje tumorskih ćelija zagrijavanjem MP-a kada su izložene oscilirajućim magnetnim poljima.Princip magnetne transfekcije, u kojem se magnetsko polje koristi kao sredstvo za transfekciju za poboljšanje prijenosa DNK u stanice, obično se koristi in vitro korištenjem niza nevirusnih i virusnih genskih vektora za ćelijske linije koje se teško mogu transducirati. ..Utvrđena je efikasnost magnetotransfekcije LV sa isporukom LV MP in vitro u ćelijsku liniju humanog bronhijalnog epitela u prisustvu statičkog magnetnog polja, povećavajući efikasnost transdukcije za 186 puta u poređenju sa samo LV vektorom.LV MT je također primijenjen na in vitro modelu cistične fibroze, gdje je magnetna transfekcija povećala LV transdukciju u kulturama sučelja zrak-tečnost za faktor 20 u prisustvu sputuma cistične fibroze10.Međutim, magnetotransfekcija organa in vivo dobila je relativno malo pažnje i procijenjena je samo u nekoliko studija na životinjama11,12,13,14,15, posebno na plućima16,17.Međutim, mogućnosti magnetne transfekcije u plućnoj terapiji cistične fibroze su jasne.Tan et al.(2020) je naveo da će „studija validacije efektivne plućne isporuke magnetnih nanočestica utrti put budućim CFTR strategijama inhalacije za poboljšanje kliničkih ishoda kod pacijenata sa cističnom fibrozom”6.
Ponašanje malih magnetnih čestica na površini respiratornog trakta u prisustvu primijenjenog magnetnog polja teško je vizualizirati i proučavati, te se stoga slabo razumiju.U drugim studijama, razvili smo metodu rendgenskog rendgenskog kontrasta zasnovanog na sinhrotronskom širenju (PB-PCXI) za neinvazivno snimanje i kvantifikaciju minutnih in vivo promjena u dubini ASL18 i ponašanju MCT19,20 za direktno mjerenje površinske hidratacije kanala plina i koristi se kao rani indikator efikasnosti tretmana.Osim toga, naša MCT metoda bodovanja koristi čestice promjera 10–35 µm sastavljene od glinice ili stakla s visokim indeksom prelamanja kao MCT markere vidljive sa PB-PCXI21.Obje metode su pogodne za snimanje niza tipova čestica, uključujući MP.
Zbog visoke prostorne i vremenske rezolucije, naši ASL i MCT testovi zasnovani na PB-PCXI su vrlo pogodni za proučavanje dinamike i obrazaca ponašanja pojedinačnih i rasutih čestica in vivo kako bi nam pomogli da razumijemo i optimiziramo metode isporuke MP gena.Pristup koji ovdje koristimo temelji se na našim studijama korištenjem SPring-8 BL20B2 beamline-a, u kojem smo vizualizirali kretanje tekućine nakon isporuke doze lažnog vektora u nazalne i plućne disajne puteve miševa kako bismo objasnili naše heterogene opažene obrasce ekspresije gena. u našem genu.ispitivanja na životinjama sa dozom nosača od 3,4.
Cilj ovog istraživanja bio je korištenje PB-PCXI sinhrotrona za vizualizaciju in vivo pokreta serije MP u dušniku živih štakora.Ove PB-PCXI studije snimanja su dizajnirane da testiraju seriju MP, jačinu magnetnog polja i lokaciju kako bi se odredio njihov uticaj na kretanje MP.Pretpostavili smo da će eksterno magnetno polje pomoći isporučenom MF-u da ostane ili da se pomakne u ciljno područje.Ove studije su nam također omogućile da odredimo konfiguracije magneta koje maksimiziraju količinu čestica preostalih u traheji nakon depozicije.U drugoj seriji studija, imali smo za cilj da iskoristimo ovu optimalnu konfiguraciju da demonstriramo obrazac transdukcije koji je rezultat in vivo isporuke LV-MP u disajne puteve pacova, uz pretpostavku da bi isporuka LV-MP u kontekstu ciljanja disajnih puteva rezultirala u povećanju efikasnosti LV transdukcije..
Sve studije na životinjama provedene su u skladu s protokolima odobrenim od strane Univerziteta u Adelaideu (M-2019-060 i M-2020-022) i SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Eksperimenti su izvedeni u skladu sa preporukama ARRIVE-a.
Sve rendgenske slike snimljene su na liniji snopa BL20XU na sinhrotronu SPring-8 u Japanu koristeći postavku sličnu prethodno opisanoj21,22.Ukratko, eksperimentalna kutija se nalazila 245 m od sinhrotronskog skladišnog prstena.Udaljenost između uzorka i detektora od 0,6 m koristi se za studije imidžinga čestica i 0,3 m za in vivo studije slikanja za stvaranje efekata faznog kontrasta.Korišten je monokromatski snop s energijom od 25 keV.Slike su dobijene pomoću rendgenskog pretvarača visoke rezolucije (SPring-8 BM3) spojenog na sCMOS detektor.Pretvarač pretvara rendgenske zrake u vidljivu svjetlost pomoću scintilatora debljine 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), koji se zatim usmjerava na sCMOS senzor koristeći ×10 (NA 0,3) objektiv mikroskopa.SCMOS detektor je bio Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) sa veličinom niza od 2048 × 2048 piksela i sirovom veličinom piksela od 6,5 × 6,5 µm.Ova postavka daje efektivnu izotropnu veličinu piksela od 0,51 µm i vidno polje od približno 1,1 mm × 1,1 mm.Trajanje ekspozicije od 100 ms je odabrano kako bi se maksimizirao omjer signala i šuma magnetnih čestica unutar i izvan disajnih puteva dok se minimiziraju artefakti pokreta uzrokovani disanjem.Za in vivo studije, brzi rendgenski zatvarač je postavljen na putanju rendgenskih zraka kako bi se ograničila doza zračenja blokiranjem snopa rendgenskog zraka između ekspozicija.
LV medijum nije korišćen ni u jednoj studiji snimanja SPring-8 PB-PCXI jer BL20XU komora za snimanje nije sertifikovana za nivo biološke bezbednosti 2.Umjesto toga, odabrali smo niz dobro okarakteriziranih MP-a od dva komercijalna dobavljača koji pokrivaju raspon veličina, materijala, koncentracija željeza i primjena, — prvo da bismo razumjeli kako magnetna polja utiču na kretanje MP-a u staklenim kapilarama, a zatim u živih disajnih puteva.površine.Veličina MP varira od 0,25 do 18 µm i napravljena je od različitih materijala (vidi tabelu 1), ali sastav svakog uzorka, uključujući veličinu magnetnih čestica u MP, nije poznat.Na osnovu naših opsežnih MCT studija 19, 20, 21, 23, 24, očekujemo da se MP do 5 µm mogu vidjeti na površini dišnih puteva traheje, na primjer, oduzimanjem uzastopnih kadrova kako bi se uočila poboljšana vidljivost pokreta MP.Jedan MP od 0,25 µm manji je od rezolucije uređaja za snimanje, ali se očekuje da će PB-PCXI otkriti njihov volumetrijski kontrast i kretanje površinske tekućine na koju se talože nakon nanošenja.
Uzorci za svaki MP u tabeli.1 je pripremljen u staklenim kapilarama od 20 μl (Drummond Microcaps, PA, SAD) unutrašnjeg prečnika 0,63 mm.Korpuskularne čestice su dostupne u vodi, dok su CombiMag čestice dostupne u vlasničkoj tekućini proizvođača.Svaka epruveta je do pola napunjena tečnošću (otprilike 11 µl) i postavljena na držač uzorka (vidi sliku 1).Staklene kapilare postavljene su vodoravno na scenu u komori za snimanje, odnosno na rubovima tečnosti.Magnet od niklovane ljuske promjera 19 mm (dužine 28 mm) napravljen od rijetke zemlje, neodimija, gvožđa i bora (NdFeB) (N35, kat. br. LM1652, Jaycar Electronics, Australija) sa ostatkom od 1,17 T bio je pričvršćen na zasebna tablica prijenosa za postizanje Daljinske promjene položaja tokom renderiranja.Rendgensko snimanje počinje kada se magnet postavi približno 30 mm iznad uzorka i slike se snimaju brzinom od 4 kadra u sekundi.Tokom snimanja, magnet je doveden blizu staklene kapilarne cijevi (na udaljenosti od oko 1 mm), a zatim se pomjerao duž cijevi kako bi se procijenio efekat jačine polja i položaja.
In vitro setup za snimanje koji sadrži MP uzorke u staklenim kapilarama u fazi translacije xy uzorka.Putanja rendgenskog snopa označena je crvenom isprekidanom linijom.
Nakon što je in vitro vidljivost MPs ustanovljena, njihova podskupina je testirana in vivo na ženkama Wistar albino pacova divljeg tipa (stare ~12 sedmica, ~200 g).Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) i butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Pacovi su anestezirani Pharma (Japan) mješavinom intraperitonealnom injekcijom.Nakon anestezije, pripremljeni su za snimanje uklanjanjem krzna oko traheje, umetanjem endotrahealne cijevi (ET; 16 Ga intravenska kanila, Terumo BCT) i imobilizacijom u ležećem položaju na posebno napravljenoj ploči za snimanje koja sadrži termalnu vrećicu. za održavanje telesne temperature.22. Ploča za snimanje je zatim pričvršćena na stepen uzorka u kutiji za snimanje pod blagim uglom da bi se traheja horizontalno poravnala na rendgenskom snimku kao što je prikazano na slici 2a.
(a) In vivo podešavanje snimanja u jedinici za snimanje SPring-8, putanja rendgenskog zraka označena crvenom tačkastom linijom.(b,c) Lokalizacija trahealnog magneta izvršena je daljinski pomoću dvije ortogonalno postavljene IP kamere.Na lijevoj strani slike na ekranu možete vidjeti žičanu omču koja drži glavu i kanilu za isporuku ugrađenu unutar ET cijevi.
Daljinski upravljani sistem pumpe šprica (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) pomoću staklenog šprica od 100 µl spojen je na PE10 cijev (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) pomoću igle od 30 Ga.Označite cijev kako biste osigurali da je vrh u ispravnom položaju u traheji prilikom umetanja endotrahealne cijevi.Koristeći mikropumpu, klip šprica je uklonjen, a vrh epruvete je uronjen u MP uzorak koji je trebao biti isporučen.Napunjena dovodna cijev je zatim umetnuta u endotrahealnu cijev, postavljajući vrh na najjači dio našeg očekivanog primijenjenog magnetnog polja.Akvizicija slike je kontrolirana pomoću detektora daha spojenog na našu Arduino-baziranu kutiju za mjerenje vremena, a svi signali (npr. temperatura, disanje, otvaranje/zatvaranje zatvarača i akvizicija slike) su snimljeni pomoću Powerlab i LabChart (AD Instruments, Sydney, Australija) 22 Prilikom snimanja Kada kućište nije bilo dostupno, dvije IP kamere (Panasonic BB-SC382) bile su postavljene pod uglom od približno 90° jedna prema drugoj i korištene za kontrolu položaja magneta u odnosu na traheju tokom snimanja (Slika 2b, c).Da bi se minimizirali artefakti pokreta, jedna slika po dahu je dobijena tokom terminalnog platoa respiratornog protoka.
Magnet je pričvršćen za drugi stepen, koji se može nalaziti udaljeno na vanjskoj strani tijela za snimanje.Testirane su različite pozicije i konfiguracije magneta, uključujući: postavljene pod uglom od približno 30° iznad traheje (konfiguracije su prikazane na slikama 2a i 3a);jedan magnet iznad životinje, a drugi ispod, sa polovima postavljenim za privlačenje (slika 3b)., jedan magnet iznad životinje i jedan ispod, sa polovima postavljenim za odbijanje (slika 3c), i jedan magnet iznad i okomito na traheju (slika 3d).Nakon postavljanja životinje i magneta i punjenja MP koji se testira u pumpu za špric, dajte dozu od 50 µl brzinom od 4 µl/sec nakon snimanja slika.Magnet se zatim pomera napred-nazad duž ili popreko traheje dok nastavlja da dobija slike.
Konfiguracija magneta za in vivo snimanje (a) jedan magnet iznad traheje pod uglom od približno 30°, (b) dva magneta konfigurisana za privlačenje, (c) dva magneta konfigurisana za odbijanje, (d) jedan magnet iznad i okomito na dušnik.Posmatrač je gledao od usta do pluća kroz dušnik i rendgenski snop je prošao kroz lijevu stranu pacova i izašao sa desne strane.Magnet se ili pomiče duž dužine disajnog puta ili lijevo i desno iznad dušnika u smjeru snopa rendgenskih zraka.
Također smo nastojali utvrditi vidljivost i ponašanje čestica u disajnim putevima u odsustvu miješanja disanja i otkucaja srca.Stoga, na kraju perioda snimanja, životinje su humano eutanazirane zbog predoziranja pentobarbitalom (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, SAD; ~65 mg/kg ip).Neke životinje su ostavljene na platformi za snimanje, a nakon prestanka disanja i otkucaja srca, proces snimanja je ponovljen, dodajući dodatnu dozu MP ako MP nije bio vidljiv na površini disajnih puteva.
Rezultirajuće slike su ispravljene za ravno i tamno polje, a zatim sastavljene u film (20 kadrova u sekundi; 15-25 × normalna brzina u zavisnosti od brzine disanja) koristeći prilagođenu skriptu napisanu u MATLAB-u (R2020a, The Mathworks).
Sve studije o isporuci vektora gena LV sprovedene su u Centru za laboratorijska istraživanja na životinjama Univerziteta u Adelaideu i imale su za cilj da koriste rezultate SPring-8 eksperimenta kako bi se procijenilo da li isporuka LV-MP u prisustvu magnetnog polja može poboljšati prijenos gena in vivo .Da bi se procenili efekti MF i magnetnog polja, tretirane su dve grupe životinja: jednoj grupi je ubrizgan LV MF sa postavljanjem magneta, a drugoj grupi kontrolna grupa sa LV MF bez magneta.
Vektori gena LV generirani su korištenjem prethodno opisanih metoda 25, 26 .LacZ vektor eksprimira nuklearno lokalizirani gen beta-galaktozidaze pokretan konstitutivnim promotorom MPSV (LV-LacZ), koji proizvodi plavi proizvod reakcije u transduciranim stanicama, vidljiv na prednjim dijelovima i dijelovima plućnog tkiva.Titracija je izvedena u ćelijskim kulturama ručnim brojanjem broja LacZ-pozitivnih ćelija pomoću hemocitometra za izračunavanje titra u TU/ml.Nosači su kriokonzervirani na -80°C, odmrznuti prije upotrebe i vezani za CombiMag miješanjem 1:1 i inkubiranjem na ledu najmanje 30 minuta prije isporuke.
Normalni Sprague Dawley pacovi (n = 3/grupa, ~2-3 anestezirana ip sa mješavinom 0,4mg/kg medetomidina (Domitor, Ilium, Australija) i 60mg/kg ketamina (Ilium, Australija) u dobi od 1 mjeseca) ip ) injekcija i nehirurška oralna kanula sa intravenskom kanilom od 16 Ga.Kako bi se osiguralo da tkivo trahealnog dišnog puta primi LV transdukciju, kondicionirano je korištenjem našeg prethodno opisanog protokola mehaničke perturbacije u kojem je površina trahealnog dišnog puta aksijalno trljana žičanom košarom (N-krug, nitinol izvlakač kamena bez vrha NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, SAD) 30 p28.Zatim, oko 10 minuta nakon perturbacije u biološkom kabinetu, izvršena je trahealna primjena LV-MP.
Magnetno polje korišćeno u ovom eksperimentu konfigurisano je slično in vivo rendgenskoj studiji, sa istim magnetima koji su držani preko dušnika sa stentama za destilaciju (Slika 4).Zapremina od 50 µl (2 x 25 µl alikvota) LV-MP je isporučena u traheju (n = 3 životinje) korištenjem pipete sa vrhom gela kao što je prethodno opisano.Kontrolna grupa (n = 3 životinje) dobila je isti LV-MP bez upotrebe magneta.Nakon završetka infuzije, kanila se uklanja iz endotrahealne cijevi i životinja se ekstubira.Magnet ostaje na mjestu 10 minuta prije nego što se ukloni.Pacovima je subkutano davan meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Australija) nakon čega je uslijedilo povlačenje anestezije intraperitonealnom injekcijom 1 mg/kg atipamazol hidrohlorida (Antisedan, Zoetis, Australija).Pacovi su držani na toplom i posmatrani do potpunog oporavka od anestezije.
LV-MP uređaj za isporuku u biološkom sigurnosnom ormaru.Možete vidjeti da svjetlosiva Luer-lock navlaka ET cijevi viri iz usta, a vrh gel pipete prikazan na slici je umetnut kroz ET cijev do željene dubine u traheju.
Nedelju dana nakon procedure davanja LV-MP, životinje su humano žrtvovane inhalacijom 100% CO2 i ekspresija LacZ je procenjena korišćenjem našeg standardnog tretmana X-gal.Tri najkaudalna hrskavična prstena su uklonjena kako bi se osiguralo da bilo kakvo mehaničko oštećenje ili zadržavanje tekućine zbog postavljanja endotrahealne cijevi neće biti uključeno u analizu.Svaka traheja je prerezana po dužini kako bi se dobile dvije polovine za analizu i stavljena u čašu koja je sadržavala silikonsku gumu (Sylgard, Dow Inc) pomoću igle Minutien (Fine Science Tools) za vizualizaciju luminalne površine.Distribucija i karakter transduciranih ćelija potvrđeni su frontalnim fotografisanjem pomoću Nikon mikroskopa (SMZ1500) sa DigiLite kamerom i softverom TCapture (Tucsen Photonics, Kina).Slike su dobijene pri uvećanju od 20x (uključujući maksimalnu postavku za punu širinu dušnika), pri čemu je cela dužina dušnika prikazana korak po korak, obezbeđujući dovoljno preklapanja između svake slike da bi se slike mogle „prošivati“.Slike iz svake traheje su zatim kombinovane u jednu kompozitnu sliku koristeći Composite Image Editor verzija 2.0.3 (Microsoft Research) koristeći algoritam planarnog kretanja. Područje ekspresije LacZ unutar trahealnih kompozitnih slika svake životinje je kvantificirano korištenjem automatizirane MATLAB skripte (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano28, koristeći postavke od 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 i Value < 0,7. Područje ekspresije LacZ unutar kompozitnih slika traheje svake životinje je kvantificirano korištenjem automatizirane MATLAB skripte (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano28, koristeći postavke od 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 i Value < 0,7. Ploča ekspresije LacZ-a u sastavnim slikama traheja svakog života bilo je količinsko određeno sa upotrebom automatizovanog scenarija MATLAB (R2020a, MathWorks), kao što je opisano ranije28, sa korištenjem nastrojeka 0,35 <ottenok <0,58, nasyŝennostʹ> 0,15 i vrijednost <0 ,7. Područje LacZ ekspresije u kompozitnim slikama dušnika svake životinje kvantificirano je korištenjem automatizirane MATLAB skripte (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano28 korištenjem postavki od 0,350,15 i vrijednost<0 ,7.如前所述,使用自动MATLAB 脚本(R2020a,MathWorks)进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述, 自动 自动 Matlab 脚本 （ (r2020a, Mathworks)表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 HIP Oblasti ekspresije LacZ-a na sastavnim slikama trahei svakog životnog kvantiteta određuju se pomoću automatizovanog scenarija MATLAB-a (R2020a, MathWorks), kako je ranije opisano, sa korišćenjem nastrojenosti 0,35 <ottenok <0,58, nasyŝennostʹ> 0,15 i vrednost <0,7 . Područja LacZ ekspresije na kompozitnim slikama traheje svake životinje kvantificirana su korištenjem automatizirane MATLAB skripte (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano korištenjem postavki od 0,35 < nijansa < 0,58, zasićenost > 0,15 i vrijednost < 0,7.Praćenjem kontura tkiva u GIMP-u v2.10.24, ručno je kreirana maska ​​za svaku kompozitnu sliku kako bi se identificirala površina tkiva i spriječila bilo kakva lažna detekcija izvan tkiva traheje.Obojene površine sa svih kompozitnih slika svake životinje su zbrojene kako bi se dobila ukupna obojena površina za tu životinju.Oslikana površina je zatim podijeljena s ukupnom površinom maske kako bi se dobila normalizirana površina.
Svaka traheja je umetnuta u parafin i izrezana debljine 5 µm.Sekcije su obojene neutralnom brzom crvenom bojom 5 minuta, a slike su dobijene pomoću mikroskopa Nikon Eclipse E400, DS-Fi3 kamere i softvera za snimanje NIS elemenata (verzija 5.20.00).
Sve statističke analize su obavljene u GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistička značajnost je postavljena na p ≤ 0,05.Normalnost je testirana pomoću Shapiro-Wilk testa, a razlike u LacZ bojenju su procijenjene korištenjem neuparenog t-testa.
Šest MP opisanih u Tabeli 1 ispitano je PCXI, a vidljivost je opisana u Tabeli 2. Dva polistirenska MP-a (MP1 i MP2; 18 µm i 0,25 µm, respektivno) nisu bila vidljiva PCXI-om, ali su preostali uzorci mogli biti identificirani (primjeri su prikazani na slici 5).MP3 i MP4 su slabo vidljivi (10-15% Fe3O4; 0,25 µm i 0,9 µm, respektivno).Iako je MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) sadržavao neke od najmanjih testiranih čestica, bio je najizraženiji.Proizvod CombiMag MP6 je teško razlikovati.U svim slučajevima, naša sposobnost detekcije MF-a je znatno poboljšana pomicanjem magneta naprijed-nazad paralelno s kapilarom.Kako su se magneti udaljavali od kapilare, čestice su se izvlačile u dugim lancima, ali kako su se magneti približavali i povećavala jačina magnetnog polja, lanci čestica su se skraćivali kako su čestice migrirale prema gornjoj površini kapilare (pogledajte Dodatni video S1 : MP4), povećavajući gustinu čestica na površini.Suprotno tome, kada se magnet ukloni iz kapilare, jačina polja se smanjuje i MP-ovi se preuređuju u dugačke lance koji se protežu od gornje površine kapilare (pogledajte Dodatni video S2: MP4).Nakon što magnet prestane da se kreće, čestice nastavljaju da se kreću neko vreme nakon što dostignu ravnotežni položaj.Kako se MP pomiče prema gornjoj površini kapilare i dalje od nje, magnetne čestice teže da povlače ostatke kroz tekućinu.
Vidljivost MP pod PCXI značajno varira između uzoraka.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Sve slike prikazane ovdje su snimljene magnetom postavljenim otprilike 10 mm direktno iznad kapilare.Prividni veliki krugovi su mjehurići zraka zarobljeni u kapilarama, jasno pokazujući crne i bijele ivice slike faznog kontrasta.Crveni okvir označava uvećanje koje pojačava kontrast.Imajte na umu da promjeri magnetnih kola na svim slikama nisu u mjerilu i da su otprilike 100 puta veći od prikazanih.
Kako se magnet kreće lijevo i desno duž vrha kapilare, ugao MP niza se mijenja kako bi se poravnao s magnetom (vidi sliku 6), čime se ocrtavaju linije magnetskog polja.Za MP3-5, nakon što tetiva dostigne granični ugao, čestice se vuku duž gornje površine kapilare.Ovo često dovodi do grupiranja MP u veće grupe u blizini mjesta gdje je magnetno polje najjače (pogledajte Dodatni video S3: MP5).Ovo je takođe posebno vidljivo pri snimanju blizu kraja kapilare, što uzrokuje da se MP agregira i koncentriše na interfejsu tečnost-vazduh.Čestice u MP6, koje je bilo teže razlikovati od onih u MP3-5, nisu se povlačile kada se magnet kretao duž kapilare, ali su se MP žice disocirale, ostavljajući čestice na vidiku (pogledajte Dodatni video S4: MP6).U nekim slučajevima, kada je primijenjeno magnetsko polje smanjeno pomicanjem magneta na veliku udaljenost od mjesta snimanja, svi preostali MP se polako spuštaju na donju površinu cijevi gravitacijom, ostajući u nizu (pogledajte Dodatni video S5: MP3) .
Ugao MP žice se mijenja kako se magnet pomiče udesno iznad kapilare.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Crveni okvir označava uvećanje koje pojačava kontrast.Imajte na umu da su dodatni videozapisi u informativne svrhe jer otkrivaju važnu strukturu čestica i dinamičke informacije koje se ne mogu vizualizirati na ovim statičnim slikama.
Naši testovi su pokazali da pomeranje magneta napred i nazad polako duž traheje olakšava vizualizaciju MF u kontekstu složenog pokreta in vivo.Nisu vršeni in vivo testovi jer polistirenske kuglice (MP1 i MP2) nisu bile vidljive u kapilari.Svaki od preostala četiri MF-a testiran je in vivo s dugom osom magneta postavljenom iznad traheje pod uglom od oko 30° u odnosu na vertikalu (vidi slike 2b i 3a), jer je to rezultiralo dužim MF lancima i bilo je efikasnije nego magnet..konfiguracija prekinuta.MP3, MP4 i MP6 nisu pronađeni u dušniku nijedne žive životinje.Prilikom vizualizacije respiratornog trakta štakora nakon humanog ubijanja životinja, čestice su ostale nevidljive čak i kada je dodavan dodatni volumen pomoću štrcaljke.MP5 je imao najveći sadržaj željeznog oksida i bio je jedina vidljiva čestica, pa je korišten za procjenu i karakterizaciju ponašanja MP in vivo.
Postavljanje magneta preko traheje tokom umetanja MF-a rezultiralo je koncentrisanjem mnogih, ali ne svih MF-ova u vidnom polju.Ulazak čestica u dušnik najbolje se zapaža kod humano eutanaziranih životinja.Slika 7 i dodatni video S6: MP5 prikazuje brzo magnetsko hvatanje i poravnavanje čestica na površini ventralne traheje, što ukazuje da MPs mogu biti ciljani na željena područja dušnika.Prilikom pretrage distalnije duž traheje nakon isporuke MF-a, neki MF-ovi su pronađeni bliže karini, što ukazuje na nedovoljnu snagu magnetnog polja za prikupljanje i zadržavanje svih MF-a, budući da su isporučeni kroz područje maksimalne jačine magnetnog polja tokom primjene tekućine.proces.Međutim, postnatalne koncentracije MP bile su veće oko područja slike, što sugerira da su mnogi MP ostali u regijama disajnih puteva gdje je primijenjena jačina magnetnog polja bila najveća.
Slike (a) prije i (b) nakon isporuke MP5 u traheju nedavno eutanaziranog štakora s magnetom postavljenim neposredno iznad područja snimanja.Prikazana oblast se nalazi između dva hrskavična prstena.Postoji nešto tečnosti u disajnim putevima pre porođaja MP.Crveni okvir označava uvećanje koje pojačava kontrast.Ove slike su preuzete iz video zapisa predstavljenog u S6: MP5 Supplementary Video.
Pomicanje magneta duž traheje in vivo rezultiralo je promjenom ugla MP lanca na površini disajnih puteva, slično onom uočenom u kapilarama (vidi sliku 8 i dodatni video S7: MP5).Međutim, u našoj studiji, MP nije bilo moguće vući po površini živih respiratornih puteva, kao što to mogu učiniti kapilari.U nekim slučajevima, MP lanac se produžava kako se magnet pomiče lijevo-desno.Zanimljivo je da smo također otkrili da lanac čestica mijenja dubinu površinskog sloja tekućine kada se magnet pomiče uzdužno duž traheje, i širi kada se magnet pomjeri direktno iznad glave, a lanac čestica rotira u vertikalni položaj (vidi Dodatni video S7).: MP5 u 0:09, dole desno).Karakterističan obrazac kretanja se promijenio kada je magnet pomaknut bočno preko vrha traheje (tj. lijevo ili desno od životinje, umjesto duž dužine dušnika).Čestice su i dalje bile jasno vidljive tokom njihovog kretanja, ali kada je magnet uklonjen iz traheje, vrhovi nizova čestica postali su vidljivi (pogledajte Dodatni video S8: MP5, počevši od 0:08).Ovo se slaže sa uočenim ponašanjem magnetnog polja pod dejstvom primenjenog magnetnog polja u staklenoj kapilari.
Uzorci slika koji prikazuju MP5 u dušniku živog anesteziranog štakora.(a) Magnet se koristi za dobijanje slika iznad i levo od traheje, zatim (b) nakon pomeranja magneta udesno.Crveni okvir označava uvećanje koje pojačava kontrast.Ove slike su iz videa prikazanog u S7-ovom dodatnom videu: MP5.
Kada su dva pola podešena u orijentaciji sjever-jug iznad i ispod traheje (tj. privlačenja; slika 3b), MP akordi su izgledali duže i bili su smješteni na bočnom zidu dušnika, a ne na dorzalnoj površini dušnika. dušnik (vidi Dodatak).Video S9:MP5).Međutim, visoke koncentracije čestica na jednom mjestu (tj. na dorzalnoj površini traheje) nisu otkrivene nakon primjene tekućine pomoću uređaja s dvostrukim magnetom, što se obično događa kod uređaja s jednim magnetom.Zatim, kada je jedan magnet konfigurisan da odbija suprotne polove (slika 3c), broj čestica vidljivih u vidnom polju nije se povećao nakon isporuke.Postavljanje obje dvije magnetne konfiguracije je izazovno zbog velike jačine magnetnog polja koje privlači ili gura magnete.Postavka je zatim promijenjena na jedan magnet koji je paralelan s disajnim putevima, ali koji prolazi kroz disajne puteve pod uglom od 90 stepeni tako da su linije sile prešle ortogonalno preko zida traheje (slika 3d), orijentacija koja je namijenjena da odredi mogućnost agregacije čestica na bočni zid.biti posmatran.Međutim, u ovoj konfiguraciji nije bilo vidljivog kretanja MF akumulacije ili kretanja magneta.Na osnovu svih ovih rezultata odabrana je konfiguracija sa jednim magnetom i orijentacijom od 30 stepeni za in vivo studije nosilaca gena (slika 3a).
Kada je životinja snimljena više puta odmah nakon što je humano žrtvovana, odsustvo ometajućeg kretanja tkiva značilo je da su se finije, kraće linije čestica mogle uočiti u jasnom međuhrskavičnom polju, koje se 'ljuljaju' u skladu s translatornim kretanjem magneta.jasno vidjeti prisustvo i kretanje MP6 čestica.
Titar LV-LacZ bio je 1,8 x 108 IU/mL, a nakon miješanja 1:1 sa CombiMag MP (MP6), životinjama je ubrizgano 50 µl trahealne doze od 9 x 107 IU/ml LV vehikuluma (tj. 4,5 x 106 TU/pac).).).U ovim studijama, umjesto pomicanja magneta tokom porođaja, fiksirali smo magnet u jednom položaju kako bismo utvrdili može li se LV transdukcija (a) poboljšati u poređenju sa vektorskom isporukom u odsustvu magnetnog polja, i (b) da li bi dišni put mogao biti fokusiran.Ćelije koje se transduciraju u magnetnim ciljnim područjima gornjih disajnih puteva.
Čini se da prisustvo magneta i upotreba CombiMag-a u kombinaciji sa LV vektorima nisu negativno uticali na zdravlje životinja, kao što je to učinio naš standardni protokol za isporuku vektora LV.Frontalne slike trahealne regije podvrgnute mehaničkoj perturbaciji (dopunska slika 1) pokazale su da je grupa tretirana LV-MP imala značajno veći nivo transdukcije u prisustvu magneta (slika 9a).U kontrolnoj grupi bila je prisutna samo mala količina plavog LacZ bojenja (slika 9b).Kvantifikacija normalizovanih regiona obojenih X-Gal-om pokazala je da je primena LV-MP u prisustvu magnetnog polja rezultirala približno 6-strukim poboljšanjem (slika 9c).
Primjer kompozitnih slika koje prikazuju trahealnu transdukciju sa LV-MP (a) u prisustvu magnetnog polja i (b) u odsustvu magneta.(c) Statistički značajno poboljšanje normalizovanog područja LacZ transdukcije u traheji uz upotrebu magneta (*p = 0,029, t-test, n = 3 po grupi, srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti).
Neutralni brzi crveno obojeni dijelovi (primjer prikazan na dodatnoj slici 2) ukazuju na to da su ćelije obojene LacZ-om prisutne u istom uzorku i na istoj lokaciji kao što je prethodno prijavljeno.
Ključni izazov u genskoj terapiji disajnih puteva ostaje precizna lokalizacija čestica nosača u područjima od interesa i postizanje visokog nivoa efikasnosti transdukcije u pokretnim plućima u prisustvu protoka vazduha i aktivnog klirensa sluzi.Za LV nosače namijenjene liječenju respiratornih oboljenja kod cistične fibroze, povećanje vremena zadržavanja čestica nosača u provodnim disajnim putevima do sada je bio nedostižan cilj.Kao što su istakli Castellani et al., upotreba magnetnih polja za poboljšanje transdukcije ima prednosti u odnosu na druge metode isporuke gena, kao što je elektroporacija, jer može kombinovati jednostavnost, ekonomičnost, lokaliziranu dostavu, povećanu efikasnost i kraće vrijeme inkubacije.i moguće nižu dozu vehikuluma10.Međutim, in vivo taloženje i ponašanje magnetnih čestica u disajnim putevima pod uticajem spoljašnjih magnetnih sila nikada nije opisano, a zapravo sposobnost ove metode da poveća nivoe ekspresije gena u netaknutim živim disajnim putevima nije dokazana in vivo.
Naši in vitro eksperimenti na PCXI sinhrotronu pokazali su da su sve čestice koje smo testirali, sa izuzetkom MP polistirena, bile vidljive u postavci za snimanje koju smo koristili.U prisustvu magnetnog polja, magnetna polja formiraju nizove, čija je dužina povezana sa vrstom čestica i jačinom magnetnog polja (tj. blizinom i kretanjem magneta).Kao što je prikazano na slici 10, strune koje opažamo nastaju kako se svaka pojedinačna čestica magnetizira i inducira vlastito lokalno magnetsko polje.Ova odvojena polja uzrokuju da se druge slične čestice skupljaju i povezuju s grupnim kretanjima struna zbog lokalnih sila iz lokalnih sila privlačenja i odbijanja drugih čestica.
Dijagram koji prikazuje (a, b) lance čestica koje se formiraju unutar kapilara ispunjenih tekućinom i (c, d) dušnik ispunjen zrakom.Imajte na umu da kapilare i dušnik nisu nacrtani u mjerilu.Panel (a) takođe sadrži opis MF-a koji sadrži čestice Fe3O4 raspoređene u lance.
Kada se magnet pomerio preko kapilare, ugao niza čestica dostigao je kritični prag za MP3-5 koji sadrži Fe3O4, nakon čega niz čestica više nije ostajao u svom prvobitnom položaju, već se pomerao duž površine u novi položaj.magnet.Ovaj efekat se verovatno javlja zato što je površina staklene kapilare dovoljno glatka da omogući ovo kretanje.Zanimljivo je da se MP6 (CombiMag) nije tako ponašao, možda zato što su čestice bile manje, imale drugačiji premaz ili površinski naboj, ili je vlasnička tečnost nosača uticala na njihovu sposobnost kretanja.Kontrast na CombiMag slici čestica je također slabiji, što sugerira da tekućina i čestice mogu imati istu gustinu i stoga se ne mogu lako kretati jedna prema drugoj.Čestice se također mogu zaglaviti ako se magnet kreće prebrzo, što ukazuje da jačina magnetnog polja ne može uvijek prevladati trenje između čestica u tekućini, što sugerira da jačina magnetnog polja i udaljenost između magneta i ciljnog područja ne bi trebali biti iznenađenje.bitan.Ovi rezultati također pokazuju da iako magneti mogu uhvatiti mnoge mikročestice koje prolaze kroz ciljno područje, malo je vjerovatno da se na magnete može osloniti da će pomjerati CombiMag čestice duž površine dušnika.Stoga smo zaključili da in vivo LV MF studije treba da koriste statička magnetna polja za fizički ciljanje određenih područja stabla disajnih puteva.
Jednom kada se čestice unesu u tijelo, teško ih je identificirati u kontekstu složenog pokretnog tkiva tijela, ali njihova sposobnost detekcije je poboljšana pomicanjem magneta horizontalno preko dušnika kako bi se "pomicale" MP žice.Iako je snimanje u realnom vremenu moguće, lakše je uočiti kretanje čestica nakon što je životinja humano ubijena.Koncentracije MP su obično bile najveće na ovoj lokaciji kada je magnet bio pozicioniran preko područja snimanja, iako su se neke čestice obično nalazile niže u traheji.Za razliku od in vitro studija, čestice se ne mogu povući niz traheju kretanjem magneta.Ovaj nalaz je u skladu sa načinom na koji sluz koja prekriva površinu traheje tipično obrađuje inhalirane čestice, zarobljava ih u sluzi i potom ih čisti kroz mehanizam muko-cilijarnog čišćenja.
Pretpostavili smo da upotreba magneta iznad i ispod traheje za privlačenje (slika 3b) može rezultirati ujednačenijim magnetnim poljem, a ne magnetskim poljem koje je visoko koncentrisano u jednoj tački, što potencijalno rezultira ujednačenijim rasporedom čestica..Međutim, naša preliminarna studija nije pronašla jasne dokaze koji podržavaju ovu hipotezu.Slično, postavljanje para magneta na odbijanje (slika 3c) nije rezultiralo većim taloženjem čestica u području slike.Ova dva nalaza pokazuju da postavka s dvostrukim magnetom ne poboljšava značajno lokalnu kontrolu usmjeravanja MP i da je rezultirajuće jake magnetske sile teško podesiti, što ovaj pristup čini manje praktičnim.Slično tome, orijentacija magneta iznad i preko traheje (slika 3d) također nije povećala broj čestica preostalih u snimljenom području.Neke od ovih alternativnih konfiguracija možda neće biti uspješne jer rezultiraju smanjenjem jačine magnetnog polja u zoni taloženja.Stoga se konfiguracija jednog magneta na 30 stepeni (slika 3a) smatra najjednostavnijim i najefikasnijim in vivo metodom testiranja.
LV-MP studija je pokazala da kada su LV vektori kombinovani sa CombiMag-om i isporučeni nakon što su bili fizički poremećeni u prisustvu magnetnog polja, nivoi transdukcije su se značajno povećali u traheji u poređenju sa kontrolama.Na osnovu studija sinhrotronske slike i LacZ rezultata, činilo se da magnetno polje može zadržati LV u traheji i smanjiti broj vektorskih čestica koje su odmah prodrle duboko u pluća.Takva poboljšanja ciljanja mogu dovesti do veće efikasnosti uz smanjenje isporučenih titara, neciljane transdukcije, upalnih i imunoloških nuspojava i troškova prijenosa gena.Važno je da se prema proizvođaču CombiMag može koristiti u kombinaciji s drugim metodama prijenosa gena, uključujući druge virusne vektore (kao što je AAV) i nukleinske kiseline.