Giardia duodenum je parazitski organizam koji uzrokuje giardiju, crijevnu infekciju posebno čestu kod male djece s kliničkim znakovima dijareje.Ranije smo izvijestili da ekstracelularni G. duodenalis pokreće aktivaciju nukleotida koji vezuju receptor 3 (NLRP3) nalik intracelularnoj oligomerizaciji i reguliše upalne odgovore domaćina kroz izlučivanje ekstracelularnih vezikula (EV).Međutim, tačni molekularni obrasci duodenokoknog EV (GEV) povezanog s patogenom koji je uključen u ovaj proces i uloga NLRP3 inflamasoma u giardijazi ostaje da se razjasni.
Rekombinantni eukariotski ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardini u GEV su konstruisani, transficirani u mišje primarne peritonealne makrofage i detektovani mjerenjem ciljnog molekula upale kaspaze-1.Provjeren je nivo ekspresije p20..G. duodenalis alfa-2 i alfa-7.3 giardini su prvobitno identifikovani merenjem inflamasoma NLRP3 (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-kaspase-1 i kaspaze-1 p20), sekrecije IL.1β nivoi, nivoi oligomerizacije apoptotičkog spotted proteina (ASC) i imunofluorescentna lokalizacija NLRP3 i ASC.Uloga NLRP3 inflamasoma u patogenosti G. duodenalis je zatim procijenjena pomoću miševa kod kojih je aktivacija NLRP3 bila blokirana (NLRP3 blokirani miševi) i praćene su patološke promjene tjelesne težine, duodenalnog parazitskog opterećenja i duodenalnog tkiva.Pored toga, istražili smo da li hiardini alfa-2 i alfa-7.3 in vivo in vivo induciraju lučenje IL-1β preko NLRP3 inflamasoma i utvrdili ulogu ovih molekula u patogenosti G. duodenalis kod miševa.
Alfa-2 i alfa-7.3 giardini induciraju aktivaciju NLRP3 inflamasoma in vitro.To je dovelo do aktivacije p20 kaspaze-1, povećanja nivoa ekspresije proteina NLRP3, pro-IL-1β i pro-caspase-1, značajnog povećanja sekrecije IL-1β, formiranja ASA mrlja u citoplazma, i indukcija oligomerizacije ASA.NLRP3 upala Gubitak penisa pogoršava patogenost G. duodenalis kod miševa.Miševi tretirani cistama gavažom od miševa blokiranih NLRP3 pokazali su povećan broj trofozoita i teška oštećenja duodenalnih resica, karakterizirana nekrotičnim kriptama sa skupljenim i grananjem.Eksperimenti in vivo su pokazali da giardini alfa-2 i alfa-7.3 mogu inducirati lučenje IL-1β putem inflamasoma NLRP3, a imunizacija giardinom alfa-2 i alfa-7.3 smanjila je patogenost G. duodenalis kod miševa.
Uzeti zajedno, rezultati ove studije sugeriraju da giardia alpha-2 i alpha-7.3 uzrokuju pojačanu regulaciju zapaljenja domaćina NLRP3 i smanjuju infektivnost G. duodenalis kod miševa, koji su obećavajući ciljevi za prevenciju giardijaze.
Giardia duodenum je ekstracelularni parazit protozoa koji živi u tankom crijevu i uzrokuje 280 milijuna slučajeva giardijaze s dijarejom godišnje, posebno među malom djecom u zemljama u razvoju [1].Ljudi se zaraze pitkom vodom ili hranom kontaminiranom cistama M. duodenuma, koje zatim ulaze u želudac i izlučuju se u želučane sokove.Trofozoiti Giardia duodenuma vežu se za epitel duodenuma, uzrokujući mučninu, povraćanje, dijareju, bol u trbuhu i gubitak težine.Osobe sa imunodeficijencijom i cističnom fibrozom podložne su infekcijama.Do infekcije može doći i oralnim i analnim seksom [2].Lijekovi kao što su metronidazol, tinidazol i nitazoksanid su poželjne opcije liječenja duodenalnih infekcija [3].Međutim, ovi lijekovi za kemoterapiju uzrokuju neželjene nuspojave kao što su mučnina, karcinogeneza i genotoksičnost [4].Stoga je potrebno razviti efikasnije strategije za prevenciju infekcije G. duodenalis.
Inflamazomi su klasa citosolnih proteinskih kompleksa koji su dio urođenog imunološkog odgovora, pomažući u obrani od invazije patogena i posreduju u upalnim odgovorima [5].Među ovim inflamazomima, inflamasom sličan nukleotidima koji vezuje nukleotide oligomerizacije (NOD) receptora 3 (NLRP3) koji vezuje nukleotide (NLRP3) je opširno proučavan jer se može otkriti različitim uzorcima uzročnika/molkularnog oštećenja (AMPP). DAMP), prepoznaje, aktivira urođeni imuni sistem.i reguliše homeostazu crijeva kod mnogih upalnih bolesti [6,7,8].Sastoji se od receptora za prepoznavanje uzoraka (PRR) NLRP3, adapterskog apoptotičkog spotted proteina (ASC) i efektorske prokapaze-1 ili prokapaze-11.Inflamasom NLRP3 djeluje kao domaćin protiv invazije patogena, kao što je uočeno u studijama Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] i Leishmania.[11], ali je također prijavljeno da aktivacija inflamasoma NLRP3 ograničava zaštitne imunološke odgovore i pogoršava progresiju bolesti, na primjer, kod crva [12].Na osnovu naših prethodnih nalaza, izvijestili smo da ekstracelularni G. duodenalis pokreće intracelularnu aktivaciju upale NLRP3 i modulira inflamatorne odgovore domaćina izlučivanjem ekstracelularnih vezikula (EVs) [13].Međutim, ostaje da se utvrdi uloga NLRP3 inflamasoma u infekciji G. duodenalis in vivo.
Giardini su prvobitno opisani kao strukturne komponente citoskeleta G. duodenalis i igraju važnu ulogu u pokretljivosti trofozoita i vezivanju epitelnih ćelija u tankom crijevu.Kako bi se bolje prilagodili okruženju i povećali svoju patogenost, trofozoiti G. duodenalis razvili su jedinstvenu strukturu citoskeleta koja se sastoji od 8 flagela, 1 srednjeg tijela i 1 trbušnog diska [14].Trofozoiti Giardia duodenuma koriste svoj citoskelet da prodru u gornji dio tankog crijeva, posebno u duodenum, i pričvrste se za enterocite.Oni konstantno migriraju i vezuju se za epitelne ćelije koristeći ćelijski metabolizam.Stoga postoji bliska veza između njihovog citoskeleta i virulencije.Giardini specifični za Giardia duodenum su komponente strukture citoskeleta [15] i podijeljeni su u četiri klase: α-, β-, γ- i δ-giardini.Postoji 21 član porodice α-giardin, od kojih svi imaju sposobnost vezanja fosfolipida zavisnu od kalcijuma [16].Oni također povezuju citoskelet sa ćelijskom membranom.Kod osoba sa dijarejom uzrokovanom G. duodenalisom, α-giardini su visoko eksprimirani i imunoreaktivni tokom infekcije [17].Heterološke vakcine zasnovane na Giardia alfa-1 zaštićene su od giardijaze kod miševa i potencijalni su antigeni kandidati za razvoj vakcine [18].Alpha-8 giardin, lokaliziran u plazma membrani i flagelama, ali ne i u ventralnom disku, pojačava pokretljivost i brzinu rasta trofozoita u G. duodenalis [19].Alfa-14 giardin se veže za strukture mikrotubula na flagelama i utiče na vitalnost G. duodenalis [20].Alfa-11 giardin je prisutan u izobilju tokom životnog ciklusa, a prekomjerna ekspresija alfa-11 giardina oštećuje sam G. duodenalis [21].Međutim, nejasno je da li alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin štite od infekcije G. duodenalis i njihovih osnovnih mehanizama.
U ovoj studiji, rekombinantni eukariotski ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine su transficirani u primarne peritonealne makrofage miša da aktiviraju NLRP3 domaćina.Ciljevi inflamasoma su zatim pregledani.Također smo procijenili ulogu NLRP3 inflamasoma u patogenosti G. duodenalis, istražili da li alfa-2 i alfa-7,3 giardini induciraju aktivaciju NLRP3 inflamasoma in vivo i utvrdili da ove dvije uloge giardina u patogenosti G. duodenalis.Naš zajednički cilj je bio da razvijemo obećavajuće ciljeve za prevenciju infekcije G. duodenalis.
Divlji tip (WT) C57BL/6 ženke miševa starosti 5-8 sedmica kupljene su od Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Kina).Miševi su imali slobodan pristup vodi, primali su steriliziranu hranu i držani su u ciklusu svjetlo/mrak od 12/12 sati.Prije infekcije, miševi su primali antibiotike ad libitum u vodi za piće sa dodatkom ampicilina (1 mg/mL), vankomicina (1 mg/mL) i neomicina (1,4 mg/mL) (sve kupljeno iz Šangaja, Kina, umjetni organizmi) [22 ].].Miševi koji su izgubili sposobnost da jedu i piju više od 24 sata i izgubili ≥ 20% tjelesne težine su humano eutanazirani dislokacijom grlića materice.
Trofozoiti WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, SAD) su dopunjeni sa 12,5% fetalnog goveđeg seruma (FBS; Every Green, Zhejiang, Kina) i 0,1% goveđe žuči (Sigma-Aldrich, St. Missouri, SAD ).SAD) u mikroaerobnim uslovima.Konfluentni trofozoiti su sakupljeni na ledu i pasirani u omjeru 1:4 za dalju reprodukciju.
Ciste Giardia duodenuma su inducirane kao što je prethodno opisano [23], trofozoiti su sakupljeni u logaritamskoj fazi, a zatim razrijeđeni medijumom koji indukuje inkapsulaciju, pH 7,1 (modifikovani TYI-S-33) do konačne koncentracije od 1 × 106 trofozoita/mL.koncentracija žuči 0,05% medij).Trofozoiti su kultivisani u anaerobnim uslovima na 37°C do logaritamske faze rasta.Promjeniti podlogu u medij za indukciju cista (pH 7,8; ​​modificirani TYI-S-33 medij sa 1% koncentracije žuči) i kultivirati G. duodenalis na 37°C tokom 48-96 sati, tokom kojih su formirane ciste promatrane pod mikroskopom.Nakon što je većina trofozoita inducirana da formira ciste, mješavina kulture je sakupljena i resuspendirana u sterilnoj deioniziranoj vodi kako bi se lizirali preostali trofozoiti.Ciste su izbrojane i pohranjene na 4°C za naknadne analize preko želučane sonde kod miševa.
Ekstracelularne vezikule Giardia (GEV) su obogaćene kao što je prethodno opisano [13].Trofozoiti u logaritamskoj fazi rasta su resuspendirani u modificiranom mediju TYI-S-33 pripremljenom sa FBS osiromašenim egzozomima (Biological Industries, Beit-Haemek, Izrael) do konačne koncentracije od 1 × 106 parazita/mL i inkubirani 12 sati.izolovani su iz supernatanta kulture centrifugiranjem na 2000 g 10 min, 10 000 g 45 min i 100 000 g 60 min.Precipitati su rastvoreni u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS), kvantifikovani korišćenjem kompleta za analizu BCA proteina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i čuvani na -80°C ili direktno upotrebljeni za dalje analize.
Primarni mišji peritonealni makrofagi pripremljeni su kako je prethodno opisano [24].Ukratko, miševima (u dobi od 6-8 sedmica) je ubrizgano (intraperitonealno [ip]) 2,5 ml 2,98% Difco tekućeg tioglikolnog medijuma (BD, Franklin Lakes, NJ, SAD) i hranjena su 3-4 nepca.Suspenzija makrofaga je sakupljena iz trbušne šupljine miševa nakon eutanazije i centrifugirana 3 puta na 1000 g po 10 minuta.Sakupljene ćelije detektovane su protočnom citometrijom korišćenjem CD11b markera sve dok čistoća ćelija nije bila >98%, a zatim su dodane u ploče sa ćelijskom kulturom sa 6 jažica (4,5 x 106 ćelija/jažici) i inkubirane sa 10% FBS (Bioindustry) na 37°C.i 5% CO2.
RNK je ekstrahirana iz 1 × 107 trofozoita u 1 ml TRIzol reagensa (Vazyme, Nanjing, Kina), genomska DNK je ekstrahirana iz ukupne RNK G. duodenalis pomoću MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kina) i sintetizirana je komplementarna DNK (cDNK) koristeći MonScript RTIIII Super Mix (Monad) prema uputama proizvođača.
Informacije o CDS sekvenci za ciljni gen G. duodenalis dobijene su od NCBI GenBank-a.Koristite Primer 5.0 da dizajnirate specifične prajmere za bešavno kloniranje za svaki ciljni gen.Prednji prajmer (5′-3′) sastoji se od tri dela: preklapajuće sekvence sa linearizovanim vektorom pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) i startnih kodona ATG i GNN (ako prva baza nije G).Ovo se radi kako bi se poboljšala efikasnost izraza.Dodatno, najmanje 16 bp kombinovanih baza (sadržaj GC 40–60%/Tm oko 55 °C).Reverzni prajmer (5′-3′) se sastoji od dva dela, preklapajuće sekvence sa EcoRV-linearizovanim vektorom pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) i kombinovane baze od najmanje 16 bp.(bez zadnje dvije stanice).baze) kodon kao što je AA ili GA kako bi se omogućilo rekombinantnim plazmidima da eksprimiraju svoje označene proteine).Sekvence prajmera su navedene u tabeli 1 i sintetizovane su od strane Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kina).
Ciljevi su amplificirani korištenjem Pfu DNK polimeraze (Tiangen, Peking, Kina) ili Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Kina) koristeći pripremljenu cDNK G. duodenalis kao šablon.Eukariotski ekspresijski vektorski plazmid pcDNA3.1(+) lineariziran je restrikcijskim enzimom EcoRV i defosforiliran korištenjem Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearizirani pcDNA3.1(+) fragmenti i amplificirani fragmenti ciljnog gena su pročišćeni korištenjem kompleta za pročišćavanje DNK gela (Tiangen) i kvantificirani korištenjem Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragment pcDNA3.1(+) i svaki fragment ciljnog gena rekombinovani su korištenjem MonClone mješavine za jednostruko kloniranje (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kina) i potvrđeni sekvenciranjem DNK korištenjem Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kina)..
Plazmidi bez endotoksina pcDNA3.1(+)-alpha-2 i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 su generirani korištenjem SanPrep Mini kompleta plazmida bez endotoksina (Sangon Biotech).Koncentracija je održavana iznad 500 ng/µl kako bi se osiguralo da EDTA u puferu za eluiranje ne interferira sa testom transfekcije.Primarni mišji peritonealni makrofagi su kultivisani u pločama sa 6 jažica sa kompletnim medijumom RPMI 1640 (Biological Industries) tokom 12 sati, zatim su ćelije isprane 3 puta u toplom PBS-u da bi se uklonili penicilin i streptomicin, a zatim u medijumu dopunjenom kompletnom podlogom.Plazmidi bez endotoksina pcDNA3.1(+)-alpha-2 i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) razrijeđeni su u 125 μl Opti-MEM reducirane serumske podloge (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Zatim je 5 µl Lipofectamine 2000 reagensa za transfekciju (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) razrijeđeno u 125 µl Opti-MEM medijuma sa niskim serumom.Pripremite komplekse liposom-DNK miješanjem razrijeđenog plazmida bez endotoksina sa Lipofectaminom 2000 i ostavljanjem smjese da stoji na sobnoj temperaturi 5 minuta.Prenesite komplekse odvojeno u ćelije u svakoj jažici i polako miješajte.Nakon 4 sata, medij ćelijske kulture je zamijenjen sa 2 ml kompletnog RPMI 1640 medijuma i kultura je nastavljena 24 sata.Svježi medij ćelijske kulture je dodan ćelijama i inkubiran u različitim vremenskim tačkama u zavisnosti od dizajna testa.
Uzorci proteina iz supernatanta i ćelijskih lizata pripremljeni su kako je prethodno opisano [25].Parametri membranskog transfera za pro-IL-1β, pro-kapazu-1, kaspazu-1 p20, NLRP3, β-aktin i His-tag bili su 200 mA/90 min.Za interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, SAD), kaspazu-1 (p20) (Adipogen, Švajcarska) i NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Švajcarska) i 1:5000 ciljajući His tag ( Amylet Scientific Wuhan, Kina) i β-aktin (Proteintech, Wuhan, Kina).
Unakrsno povezivanje sa disukcinimid suberatom (DSS) izvedeno je kao što je prethodno opisano [26].Ćelije su isprane 3 puta hladnim PBS-om i potpuno lizirane iglom od 27 u 50 µl ASC reakcijskog pufera (pH 8,0) koji sadrži 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES i 125 mM NaHCO3.Smjesa je centrifugirana na 5000 g 3 min i pelet je zašiven sa 10 µl DSS (25 mM u DMSO) i 40 µl ASC reakcionog pufera 30 min na 37°C.Nakon centrifugiranja na 5000 g tijekom 10 minuta, pelet je otopljen u otopini od 40 µl ASC reakcijskog pufera i 10 µl 6x pufera za punjenje proteina (TransGen, Peking, Kina), a zatim je otopina ugašena na sobnoj temperaturi 15 min., Zatim kuhajte 10 minuta.Uzorci proteina su zatim podvrgnuti Western blot-u korištenjem primarnih anti-ASC antitijela (Wanleibio, Shenyang, Kina) u omjeru razblaženja od 1:500.
Prateći prethodno opisanu proceduru [13], sakupljeni su supernatanti ćelijske kulture i određena je sekrecija proinflamatornog citokina IL-1β korištenjem IL-1 Beta ELISA kompleta miša (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Pretvorite vrijednosti OD450nm u koncentracije proteina koristeći standardnu ​​krivu IL-1β.
Ćelije obložene pokrovnim stakalcima su nježno isprane 3 puta u toplom PBS-u, fiksirane u fiksator ćelija tkiva (Biosharp, Peking, Kina) 10 minuta na sobnoj temperaturi (RT), u 0,1% Triton X-Permeabilize na 100 (razrijeđen u PBS-u; Biosharp ) 20 minuta na sobnoj temperaturi i blokirajte u 5% goveđeg serumskog albumina (u PBS) 2 sata na sobnoj temperaturi.Ćelije su zatim inkubirane preko noći na 4°C s primarnim antitijelima protiv ASC (1:100 razrjeđenje) ili NLRP3 (1:100 razrjeđenje), respektivno, i Cy3 označenim kozjim anti-zečjim IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, Kalifornija, SAD) ili FITC-konjugirani kozji anti-mišji IgG (1:400; Earthox) preko noći na 37°C u mraku 1 sat.Jezgra su obojena Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kina) 5 minuta i posmatrana pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus Corporation, Tokio, Japan).
Miševi su podijeljeni u četiri grupe (n = 7 u svakoj grupi): (i) negativna kontrolna grupa tretirana PBS (samo PBS; davanje 100 µl/miš PBS-a nakon čega slijedi dnevna intraperitonealna injekcija 100 µl/miš PBS-a 3 sata kasnije)., neprekidno 7 dana);(ii) negativna kontrolna grupa tretirana inhibitorom MCC950 [27] (100 µl/mišu putem PBS sonde, 3 sata kasnije, 10 mg/kg tjelesne težine [BW] MCC950 [u PBS] je davan intraperitonealno dnevno, trajanje 7 dana);(iii) grupa infekcije ciste G. duodenalis (1,5 x 106 cista/mišu putem sonde, 3 sata kasnije, 100 μl/mišu PBS intraperitonealno davan dnevno tokom 7 dana);(iv) G. duodenalis cista kombinovana infekcija grupa za lečenje MCC950 inhibitorima (1,5×106 cista/miš putem sonde, 10mg/kg telesne težine MCC950 intraperitonealno dnevno tokom 7 dana u 3h).Tjelesna težina svakog miša je praćena dnevno i svi miševi su eutanazirani 7. dana.Sakupljeni duodenum (dužine 3 cm) isječen je na male komadiće u 1 ml PBS-a, ciste su uništene preko noći u PBS-u na 4°C, a G. duodenalis trofozoiti.Svježi duodenum (dužine 1 cm) izolovan je za bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E).
Miševi su podijeljeni u dvije grupe: (i) MOCK kontrolna grupa i (ii) grupa inhibitora MCC950.Bilo je pet tretmana u svakoj grupi (n = 7 po grupi tretmana): (i) negativna kontrolna grupa tretmana PBS (samo PBS; 100 µl/miš PBS, intramuskularna (IM) injekcija (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plazmid negativna kontrolna grupa (100 µg/mišja DNK, putem intramuskularne injekcije (iii) pozitivna kontrolna grupa za infekciju cistom G. duodenalis (1,5 x 106 cista/miš, putem sonde) (iv) a); grupa tretirana plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/mišja DNK, intramuskularnom injekcijom) i (v) grupa tretirana plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/miš) DNK, nakon 12 sati prolaska, miševi u grupi inhibitora MCC950 primali su dnevnu intraperitonealnu injekciju MCC950 (10 mg/kg tjelesne težine) tokom 7 dana, dok su miševi u MOCK grupi primali jednaku količinu PBS tretmana. Uzorci krvi su uzeti sakupljeni iz očnih jabučica miševa i ostavljeni preko noći na 4 °C. Uzorci seruma su izolovani pomoću enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA) za i mjerenja nivoa IL-1β.
Trideset pet miševa je podijeljeno u pet grupa (n=7 po grupi).Grupa 1 je bila negativna kontrolna grupa tretirana PBS: miševi su primili 100 μl PBS intramuskularno i 3 dana kasnije putem sonde.Grupa 2 je pozitivna kontrolna grupa inficirana cistama G. duodenalis: miševima je ubrizgano 100 μl PBS-a, a 3 dana kasnije 1,5 x 106 cista/mišu je ubrizgano intragastrično.Treća grupa – imunizacija plazmidom pcDNA3.1(+) u kombinaciji sa kontrolnom grupom za infekciju cistom duodenuma: miševi su primili 100 μg plazmidne DNK pcDNA3.1(+)(im) oralno, 1,5×106 cista/miš 3 za nekoliko dana.Grupe 4 i 5 bile su rekombinantni pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardinski plazmid ili pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardinski plazmid u kombinaciji sa infekcijom ciste G. duodenalis.Eksperimentalna grupa: miševi su primili 100 µg pcDNA3.1(+)-giardin plazmid DNK (im), zatim 3 dana kasnije, 1,5 × 106 cista/mišu je ubrizgano putem sonde.Telesna težina svakog miša je praćena nakon uvođenja ciste G. duodenalis kroz cev.Sakupljen je svjež duodenum za mjerenje parazitskog opterećenja i analizu bojenja HE.
Histopatološke promjene su analizirane prema ranije objavljenoj proceduri [30].Svježi duodenum je fiksiran fiksatorom za ćelije tkiva, stavljen u parafin, isječen na 4 μm sekcije, obojen H&E i analiziran pod svjetlosnim mikroskopom.Reprezentativne patološke promjene u sedam dijelova tkiva kod sedam nezavisnih miševa procijenio je patolog koji nije bio svjestan tretmana i snimljene su pri povećanju od 200x.Dužina resica i dubina kripta mjerene su prema prethodno opisanim metodama.
Rezultati in vitro i in vivo su dobijeni u tri primjerka.Grafovi su generisani korišćenjem GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornija, SAD).Razlike između dvije grupe analizirane su t-testom, dok su razlike između ≥3 grupe analizirane jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) korištenjem SPSS softvera (verzija 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, SAD).Podaci su analizirani na homogenost varijanse korištenjem Levenovog testa praćenog Bonferronijevim post hoc testom (B).Značajnost je izražena kao P<0,05, P<0,01 i P<0,001 (nije značajno [ns]) (P>0,05).
Naša prethodna analiza GEV proteomike u Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pokazala je da mnoge mete mogu biti uključene u aktivaciju upalnih signalnih puteva [13].Odabrali smo dvije obećavajuće mete, alfa-2 i alfa-7.3 giardine, amplificirali ove molekule i koristili ih za konstruiranje pcDNA3.1(+) eukariotskog ekspresijskog vektora.Nakon sekvenciranja, rekombinantni plazmidi ekspresije pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardina transficirani su u primarne mišje peritonealne makrofage, a identificiran je protein s potpisom kaspaze-1 p20 (fragment aktivirane kaspaze-1) kao razjašnjavanje ključnih molekula koji mogu izazvati upalu.Rezultati su pokazali da alfa-2 i alfa-7.3 giardini mogu izazvati ekspresiju p20 kaspaze-1 sličnu GEV.Nije pronađen nikakav uticaj na aktivaciju kaspaze-1 u netretiranoj negativnoj kontroli (samo PBS) i kontroli plazmida pcDNA3.1(+) (Slika 1).
Mjerenje aktivacije p20 kaspaze-1 pomoću pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardina.Rekombinantni eukariotski ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardini (iznad svake trake) su transficirani u primarne mišje peritonealne makrofage i supernatanti kulture su sakupljeni 24 sata kasnije.Western blotting je korišten za mjerenje nivoa ekspresije signaturnog proteina kaspaze-1 p20 inflamasoma.Grupa koja je koristila samo PBS (traka C) i pcDNA3.1(+) monoterapijska grupa (stanica pcDNA3.1) korištene su kao negativna kontrola, a grupa za liječenje GEV korištena je kao pozitivna kontrola.Ekspresija rekombinantnog proteina je potvrđena detekcijom histidinske oznake u svakom proteinu, a očekivane trake proteina bile su alfa-2 giardin (38,2 kDa) i alfa-7,3 giardin (37,2 kDa).GEV, ekstracelularne vezikule Giardia duodenuma, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearizirani vektor, SUP, supernatant
Da bi se utvrdilo da li alfa-2 giardin i alfa-7.3 giardin induciraju ekspresiju p20 kaspaze-1 i igraju li ulogu u aktiviranju inflamatornog odgovora domaćina NLRP3, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin i pcDNA3.1(+)-alpha -7,3 giardina je transficirano u primarne mišje peritonealne makrofage sa rekombinantnom plazmidnom DNK, a određeni su nivoi ekspresije, lokalizacije i oligomerizacije ključnih inflamatornih proteina NLRP3.U ovom eksperimentu, GEV je korišten kao pozitivna kontrolna grupa, a grupa bez tretmana (samo PBS) ili grupa koja je tretirana transfekcijom pcDNA3.1(+) bila je negativna grupa.Rezultati su pokazali da je, kao iu grupi GEV, rekombinantna plazmidna DNK giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 i giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 rezultirala povećanjem regulacije NLRP3, pro-IL-1β i aktivacija prokapaze-1 i kaspaze-1 (slika 2a).Osim toga, oba giardina su izazvala značajno lučenje IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Slika 2b).Većina ASC proteina bila je monomerna u grupi koja nije tretirana ili u grupi koja je tretirana transficiranom pcDNA3.1(+) plazmidom, za razliku od pcDNA3.1(+)-alpha-2 ili pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardine.ASC oligomerizacija se dogodila u rekombinantnoj plazmidnoj DNK GEV pozitivne kontrolne grupe ili grupe, pokazujući oligomerni oblik (Slika 2c).Ovi preliminarni podaci sugeriraju da alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin mogu izazvati aktivaciju upale NLRP3.Naknadne imunofluorescentne studije lokalizacije ASC i NLRP3 pokazale su da je u negativnoj kontrolnoj grupi ASC protein bio rasut po citoplazmi i pojavio se kao tačkasti signal nakon stimulacije pcDNA3.1(+)-alpha-2 sa giardinom ili pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 giardin grupa ili GEV pozitivna kontrolna grupa (Slika 2d).U grupama s negativnom kontrolom i plazmidima tretiranim pcDNA 3.1, signal proteina NLRP3 nije detektovan, dok fluorescentna signalna tačka kao odgovor na pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ili pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 je otkriven..giardine se nalaze u citoplazmi ili nakon stimulacije HEV (slika 2e).Ovi podaci dalje pokazuju da G. duodenalis giardin alpha-2 i giardin alpha-7.3 aktiviraju inflamasom NLRP3 u primarnim peritonealnim makrofagima miša.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin aktiviraju inflamasom NLRP3 u peritonealnim makrofagima miša.Transficirajte rekombinantne eukariotske ekspresijske plazmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin u primarne mišje peritonealne makrofage i ćelije, ili sakupite supernatant u roku od 24 h za analizu ekspresije, oligomer , sekrecija.i lokalizacija ključnih inflamatornih proteina.Grupa sa samo PBS (C) i pcDNA3.1(+) grupa sa pojedinačnim tretmanom korišćene su kao negativna kontrola, a grupa za tretman GEV je korišćena kao pozitivna grupa.a Ključni inflamatorni proteini NLRP3, uključujući NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspazu-1 i p20 kaspazu-1, otkriveni su Western blotingom.b Nivoi sekrecije IL-1β u supernatantima određivani su pomoću enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA).Razlike između kontrolne i eksperimentalne grupe analizirane su jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) korištenjem SPSS softvera verzije 22.0.Zvjezdica označava značajne razlike između grupa **P<0,01 i ***P<0,001.c Nivoi oligomerizacije ASC u peletima određeni su DSS analizom unakrsnog povezivanja, dok su nivoi ASC u ćelijskim lizatima korišćeni kao kontrola opterećenja.d Vizualizacija lokalizacije ISC uz pomoć imunofluorescencije.Imunofluorescencija je korištena za vizualizaciju lokalizacije NLRP3.ASC, apoptotički protein nalik na mrlje;IL, interleukin;NLRP3, nukleotid-vezujući receptor sličan oligomerizaciji 3;ns, nije značajno (P > 0,05)
I G. duodenalis i GEV-ovi koje luči aktiviraju NLRP3 inflamasom i regulišu upalne odgovore domaćina in vitro.Dakle, uloga NLRP3 inflamasoma u patogenosti G. duodenalis ostaje nejasna.Da bismo istražili ovaj problem, osmislili smo eksperiment između miševa inficiranih cistom G. duodenalis i miševa inficiranih cistom G. duodenalis + tretman inhibitorom MCC950 i uporedili ekspresiju inflamasoma NLRP3 kada su inficirani cistom G. duodenalis.Detaljna šema eksperimenta prikazana je na slici 3a.Promjene tjelesne težine miševa u različitim tretiranim grupama praćene su 7 dana nakon infekcije cistama, a rezultati su prikazani na slici 3b.U poređenju sa grupom tretiranom čistim PBS, rezultati su pokazali da (i) tjelesna težina miševa inficiranih cistom G. duodenalis opada od 3. do 7. dana nakon infekcije;(ii) tretman sa MCC950 inhibitorom nije imao značajan uticaj na tjelesnu težinu miševa..U poređenju sa grupom sa jednom infekcijom, BW grupe sa infekcijom duodenuma tretirane sa MCC950 smanjio se u različitim stepenima (1. dan: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; 2. dan: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0,6497, P=0,0645: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202;Ovi podaci pokazuju da inflamasom NLRP3 štiti miševe od značajnog gubitka težine u ranim fazama (2-4 dana) duodenalne infekcije.Zatim smo imali za cilj da otkrijemo trofozoite G. duodenalis u tečnosti za ispiranje dvanaestopalačnog creva i rezultati su prikazani na slici 3c.U poređenju sa grupom infekcije cistom G. duodenalis, broj trofozoita u duodenumu se značajno povećao nakon blokiranja inflamasoma NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Tkiva dvanaesnika obojena HE su pokazala, u poređenju sa negativnom kontrolom tretiranom samo PBS-om i MCC950: (i) Infekcija ciste G. duodenalis rezultirala je oštećenjem resica duodenuma (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) i atrofija kripte (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum od miševa inficiranih cistama G. duodenalis i tretiranih inhibitorima MCC950.Resice duodenuma su oštećene i mrtve (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) sa atrofijom i grananjem kripte (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Sl. 3d- f) .Ovi rezultati sugeriraju da inflamasom NLRP3 igra ulogu u smanjenju patogenosti G. duodenalis.
Uloga NLRP3 inflamasoma u infekciji Giardia duodenum.Miševi su uzeti (iv) sa duodenokoknim cistama i zatim tretirani sa ili bez MCC950 (ip).Grupe sa pojedinačnim tretmanom sa PBS ili MCC950 korišćene su kao kontrole.Eksperimentalna grupa i režim liječenja.b Telesna težina miševa u svakoj od različitih tretiranih grupa praćena je 7 dana.Razlika između grupe zaražene G. duodenalis i grupe za lečenje infekcije G. duodenalis + MCC950 analizirana je t-testom korišćenjem SPSS softvera verzije 22.0.Zvezdice označavaju značajne razlike na *P<0,05, **P<0,01 ili ***P<0,001.c Opterećenje parazitima je određeno brojanjem trofozoita u tečnosti za ispiranje duodenuma.Razlika između grupe zaražene G. duodenalis i grupe za lečenje infekcije G. duodenalis + MCC950 analizirana je t-testom korišćenjem SPSS softvera verzije 22.0.Zvjezdica označava značajne razlike pri *P < 0,05.d Rezultati duodenalne histopatologije bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E).Crvene strelice označavaju oštećenje resica, zelene strelice označavaju oštećenje kripta.Skala bar: 100 µm.e, f Statistička analiza visine resica duodenuma i visine mišje kripte.Zvjezdica označava značajne razlike pri *P<0,05 i **P<0,01.Rezultati su uzeti iz 7 nezavisnih bioloških eksperimenata.BW, tjelesna težina;ig, intragastrični put isporuke;ip, intraperitonealni put isporuke;ns, nije značajno (P > 0,05);PBS, fiziološka otopina puferirana fosfatom;WT, divlji tip
Lučenje IL-1β je znak aktivacije upale.Da bismo utvrdili da li G. duodenalis alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin aktiviraju in vivo NLRP3 inflamazom domaćina, koristili smo netretirane WT miševe (lažna grupa) i miševe blokirane NLRP3 inflamazomom (MCC950 inhibirana tretirana grupa).Detaljna šema eksperimenta prikazana je na slici 4a.Eksperimentalne grupe su se sastojale od miševa tretiranih PBS-om, tretmanom ciste G. duodenalisa gavažom, intramuskularnom injekcijom pcDNA3.1 i intramuskularnom injekcijom pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina ili pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina.Sedmog dana nakon intramuskularne primjene rekombinantnog plazmida, sakupljen je serum i određen je nivo IL-1β u svakoj grupi.Kao što je prikazano na slici 4b, u MOCK grupi: (i) u poređenju sa grupom PBS, tretman pcDNA3.1 nije imao značajan uticaj na sekreciju IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), međutim, Sekrecija IL-β je bila značajno povišena u grupi cista G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine i pcDNA3.1- Intramuskularna injekcija alfa-7,3 giardina značajno je povećala nivoe IL-1β u serumu (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardin inducira visoke nivoe sekrecije IL-1β u grupi za intramuskularnu injekciju pcDNA3.1-alpha-2 giardina (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .U poređenju sa svakom grupom u grupi koja je primala MCC950 i grupi MOCK: (i) Nivoi sekrecije IL-1β u PBS kontrolnoj grupi i pcDNA3.1 kontrolnoj grupi smanjili su se do određene mjere nakon blokiranja inhibitora MCC950, ali razlika nije bila značajan (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) nakon blokiranja MCC950., lučenje IL-1β je značajno smanjeno u grupi inficiranoj cistom G. duodenalis, grupi pcDNA3.1-alpha-2 giardinom i grupi pcDNA3.1-alpha-7.3 giardinom (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine (9, ANOVA58); ) = 3,540, P = 0,0164).Ovi rezultati sugeriraju da alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin posreduju u aktivaciji NLRP3 inflamasoma in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardini aktiviraju in vivo inflamazom domaćina NLRP3.Miševi su imunizirani (IM) sa rekombinantnim eukariotskim ekspresijskim plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardinom ili pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardinom i zatim tretirani sa MCC950 (ip; MCC950 grupa) ili ne (lažna grupa ).Grupa tretirana PBS ili pcDNA3.1(+) plazmidom je korištena kao negativna kontrola, grupa tretirana cistom G. duodenalis je korištena kao pozitivna kontrola.Eksperimentalna grupa i režim liječenja.b Nivoi IL-1β u serumu kod miševa su izmjereni 7. dana ELISA testom.Razlike između grupa u MOCK grupi analizirane su jednosmernom ANOVA, a razlike između MOCK grupe i MCC950 grupe su analizirane korišćenjem t-testa softvera SPSS verzije 22.0.Zvjezdica označava značajne razlike između tretiranih grupa u MOCK grupi, *P<0,05 i ***P<0,001;znakovi dolara ($) ukazuju na značajne razlike između svake grupe u MOCK grupi i MCC950 grupi na P<0,05.Rezultati sedam nezavisnih bioloških eksperimenata.i, intramuskularna injekcija, ns, nije značajno (P > 0,05)
Da bismo istražili učinak alfa-2 i alfa-7,3 giardinom posredovane aktivacije inflamasoma domaćina NLRP3 na infektivnost G. duodenalis, koristili smo WT C57BL/6 miševe i ubrizgali alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin.plazmid je ubrizgan intramuskularno, nakon 3 dana kroz želudačnu sondu ciste G. duodenalis, nakon čega su miševi posmatrani 7 dana.Detaljna šema eksperimenta prikazana je na slici 5a.Svakodnevno je mjerena tjelesna težina svakog miša, uzorci svježeg duodenalnog tkiva sakupljani su 7. dana nakon primjene kroz gastričnu sondu, mjeren je broj trofozoita i uočene su histopatološke promjene.Kao što je prikazano na slici 5b, sa povećanjem vremena hranjenja, BW miševa u svakoj grupi postepeno se povećavao.MT miševa počeo je da se smanjuje 3. dana nakon intragastrične primjene cista G. duodenalis, a zatim se postepeno povećavao.Aktivacija inflamasoma NLRP3 izazvana intramuskularnom injekcijom alfa-2 giardina i alfa7.3 giardina značajno je umanjila gubitak težine kod miševa (1. dan: pcDNA3.1-alpha-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 1,399 = 0,9754 Dan 1: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Dan 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 Dan 2: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, F; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dan 3: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Dan 4: pcDNA3.1-alpha-AN; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4. dan: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, dan 5: pcDNA3.1-alpha 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dan 5: pcDNA3.1-alpha -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dan 6: .1 kom -DNA alpha-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, dan 6: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dan 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dan 7: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Opterećenje parazitima je procijenjeno u duodenumu (slika 5c).U poređenju sa netretiranom pozitivnom kontrolom i grupom kojoj je ubrizgan prazan vektor pcDNA3.1, broj trofozoita G. duodenalis je značajno smanjen u grupama kojima je ubrizgan α-2 giardin i α-7,3 giardin (pcDNA3.1-alpha -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Pored toga, giardin alfa-7.3 je bio zaštitniji kod miševa od giardina alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Rezultati HE bojenja prikazani su na sl.5d–f.Miševi kojima je ubrizgan alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin imali su manje lezija na duodenalnom tkivu, koje su se manifestovale oštećenjem resica, u poređenju sa miševima kojima je ubrizgan G. duodenalis i miševima kojima je ubrizgan G. duodenalis u kombinaciji sa praznim pcDNA3 vektorom .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 ili P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 ili P = 0,0055) i smanjena atrofija kripte (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 ili P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-2 giardine:AN 7.3 , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ili P = 0,0191).Ovi rezultati sugeriraju da alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin smanjuju infektivnost G. duodenalis aktivacijom NLRP3 inflamasoma in vivo.
Uloga pcDNA3.1(+)-giardina u infekciji G. duodenalis.Miševi su imunizirani (IM) sa rekombinantnim eukariotskim ekspresijskim plazmidima pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardinom ili pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardinom, a zatim izazvani cistama G. duodenalis (ig).PBS grupa i grupa za tretman pcDNA3.1(+) + duodenalne ciste korišćene su kao negativna kontrolna grupa, a grupa za lečenje ciste duodenuma je korišćena kao pozitivna kontrolna grupa.Eksperimentalna grupa i režim liječenja.b MT miševa u svakoj od različitih tretiranih grupa je praćen 7 dana nakon izazivanja.Zvezdice označavaju značajne razlike između grupa u grupi G. duodenalis i grupi pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001;znak dolara ($) ukazuje na značajnu razliku između svake grupe G. duodenalis i grupe pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0.01 i $$$P<0.001.c Opterećenje parazitima je određeno prebrojavanjem broja trofozoita u 1 ml duodenalnog ispiranja iz duodenuma (dužine 3 cm) i izraženo kao broj parazita po cm duodenuma.Razlike između grupe inficirane G. duodenalis, grupe pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardina i grupe pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardina analizirane su jednosmjernom ANOVA-om korištenjem SPSS softvera verzije 22.0.Zvezdice označavaju značajne razlike kod **P<0,01 i ***P<0,001.d Histopatološke promjene u duodenumu.Crvene strelice označavaju oštećenje resica, zelene strelice označavaju oštećenje kripta.Skala bar: 100 µm.e, f Statistička analiza visine resica duodenuma miša (e) i visine kripte (f).Razlike između grupa na slici 1d analizirane su jednosmjernom ANOVA-om korištenjem SPSS softvera verzije 22.0.Zvjezdica označava značajne razlike pri *P<0,05 i **P<0,01.Rezultati sedam nezavisnih bioloških eksperimenata.ns, nije značajno (P > 0,05)
Giardia duodenum je dobro poznati crijevni parazit ljudi i drugih sisara koji uzrokuje giardiju.Godine 2004. uključen je u Inicijativu SZO za zanemarene bolesti zbog svoje visoke prevalencije tokom 6 godina, posebno u zajednicama niskog socioekonomskog statusa [32].Urođeni imuni sistem igra ključnu ulogu u imunološkom odgovoru na infekciju G. duodenalis.Prijavljeno je da mišji makrofagi gutaju i ubijaju G. duodenalis oslobađanjem ekstracelularnih zamki [33].Naše prethodne studije su pokazale da G. duodenalis, neinvazivni ekstracelularni parazit, aktivira p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 i NLRP3 inflamatorne signalne puteve u makrofagima miša da reguliše upalne odgovore domaćina, a oslobođeni GEV može poboljšati ovaj proces.13], 24].Međutim, tačni PAMP-ovi uključeni u upalu reguliranu NLRP3 inflamazomom u GEV-u i uloga NLRP3 inflamasoma u giardijazi ostaje da se razjasni.Da bismo rasvijetlili ova dva pitanja, sproveli smo ovo istraživanje.
NLRP3 inflamasom se nalazi u citoplazmi imunih ćelija i može se aktivirati raznim česticama kao što su kristali mokraćne kiseline, toksini, bakterije, virusi i paraziti.U bakterijskim studijama, toksini su identificirani kao ključni PAMP-ovi koji aktiviraju upalne senzore, što dovodi do upale i smrti stanica [34].Neki strukturno različiti toksini, kao što su hemolizin iz Staphylococcus aureus [35] i Escherichia coli [36], hemolizin BL (HBL) iz enterotoksina (NHE) [37], induciraju aktivaciju NLRP3 inflamacije.Virusne studije su pokazale da su proteini virulencije kao što su SARS-COV-2 protein ovojnice (E) [38] i NS5 protein Zika virusa [39] važni PAMP-ovi koje prepoznaje NLRP3 receptor.U studijama o parazitima, prijavljeno je da su mnogi paraziti povezani sa aktivacijom inflamasoma domaćina, kao što su Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] i Leishmania [42].Proteini gustih granula GRA35, GRA42 i GRA43, povezani sa virulencijom Toxoplasma gondii, potrebni su za indukciju piroptoze u makrofagima Lewis pacova [43].Osim toga, neke studije Leishmania fokusirale su se na pojedinačne molekule uključene u inflamasom NLRP3, kao što je lipofosfoglikan membrane parazita [44] ili cink metaloproteaza [45].Među alfa-giardin familijom gena sličnih aneksinu, alfa-1 giardin se pokazao kao potencijalni kandidat za vakcinu koji pruža zaštitu od G. duodenalis na mišjem modelu [18].U našoj studiji odabrali smo faktore virulencije G. duodenalis alfa-2 i alfa-7,3 giardine, koji su jedinstveni za giardiju, ali su relativno manje prijavljeni.Ova dva ciljna gena su klonirana u vektor pcDNA3.1(+) eukariotskog sistema ekspresije radi analize aktivacije upale.
U našem modelu miša, cijepani fragmenti kaspaze služe kao markeri upalne aktivacije.Nakon stimulacije, NLRP3 stupa u interakciju sa ASC, regrutuje prokaspaze i stvara aktivne kaspaze koje cijepaju pro-IL-1β i pro-IL-18 u zrele IL-1β i IL-18, respektivno -18.Inflamatorne kaspaze (kapaze-1, -4, -5 i -11) su očuvana porodica cisteinskih proteaza koje su kritične za urođenu odbranu i uključene su u upalu i programiranu ćelijsku smrt [46].Kaspaza-1 se aktivira kanonskim inflamazomima [47], dok se kaspaze-4, -5 i -11 cijepaju tokom formiranja atipičnih inflamasoma [48].U ovoj studiji, koristili smo peritonealne makrofage miša kao model i istraživali p20 kaspazu-1 odcijepljenu kaspazu-1 kao marker aktivacije inflamacije domaćina NLRP3 u studijama infekcije G. duodenalis.Rezultati su pokazali da su mnogi alfa-giardini odgovorni za tipičnu aktivaciju upale, što je u skladu s otkrićem ključnih molekula virulencije uključenih u bakterije i viruse.Međutim, naša studija je samo preliminarni pregled i postoje i drugi molekuli koji mogu aktivirati neklasične inflamasome, jer je naša prethodna studija otkrila i klasične i neklasične inflamasome u infekciji G. duodenalis [13].Da bismo dalje utvrdili da li je generirana p20 kaspaza-1 povezana s inflamazomom NLRP3, transficirali smo alfa-2 i alfa-7,3 giardine u mišje peritonealne makrofage kako bismo odredili nivoe ekspresije ključnih molekulskih proteina i nivoe oligomerizacije ASC, potvrđujući da se oba α-giardina aktiviraju. inflamazom NLRP3.Naši rezultati se neznatno razlikuju od onih Manko-Prykhoda et al., koji su izvijestili da stimulacija Caco-2 stanica samo sojevima G. muris ili E. coli EPEC može povećati intenzitet fluorescencije NLRP3, ASC i kaspaze-1, iako ne značajno, dok je kostimulacija G. muris i E. coli povećala nivoe tri proteina [49].Ovo neslaganje može biti posljedica razlika u odabiru vrsta Giardia, ćelijskih linija i primarnih ćelija.Takođe smo izvršili in vivo testove koristeći MCC950 na 5-nedeljnim ženkama miševa WT C57BL/6, koji su osetljiviji na G. duodenalis.MCC950 je moćan i selektivan inhibitor NLRP3 malih molekula koji blokira kanonsku i nekanonsku aktivaciju NLRP3 u nanomolarnim koncentracijama.MCC950 inhibira aktivaciju NLRP3, ali ne utiče na aktivaciju AIM2, NLRC4 i NLRP1 inflamatornih puteva ili TLR signalnih puteva [27].MCC950 blokira aktivaciju NLRP3, ali ne inhibira pokretanje NLRP3, efluks K+, priliv Ca2+ ili interakciju između NLRP3 i ASC;umjesto toga, on inhibira aktivaciju inflamasoma NLRP3 blokiranjem ASC oligomerizacije [27].Stoga smo koristili MCC950 u in vivo studiji da odredimo ulogu inflamasoma NLRP3 nakon injekcije giardina.Aktivirana kaspaza-1 p10 cijepa proinflamatorne citokine pro-IL-1β i pro-IL-18 u zrele IL-1β i IL-18 [50].U ovoj studiji, nivoi IL-1β u serumu kod miševa tretiranih giardinom sa ili bez MCC950 korišteni su kao indikator da li je aktiviran inflamasom NLRP3.Kao što se i očekivalo, tretman MCC950 je značajno smanjio nivoe IL-1β u serumu.Ovi podaci jasno pokazuju da G. duodenalis giardin alfa-2 i giardin alfa-7.3 mogu aktivirati NLRP3 mišji inflamasom.
Značajni podaci akumulirani tokom protekle decenije pokazali su da je IL-17A glavni regulator imuniteta protiv G. muris, koji indukuje IL-17RA signalizaciju, proizvodi antimikrobne peptide i reguliše aktivaciju komplementa [51].Međutim, infekcija Giardia se češće javlja kod mladih odraslih osoba, a prijavljeno je da infekcija Giardia kod mladih miševa ne aktivira odgovor IL-17A da bi pokazao svoj zaštitni učinak [52], što je navelo istraživače da potraže druge imunomodulatorne Giardia.mehanizmi infekcije helmintima.Autori nedavne studije su izvijestili da G. muris može aktivirati inflamasom NLRP3 od strane E. coli EPEC, koji potiče proizvodnju antimikrobnih peptida i smanjuje njegov kapacitet vezivanja i broj trofozoita u crijevnom traktu, čime se smanjuje ozbiljnost debelog crijeva bolesti uzrokovane bacilima [49].NLRP3 inflamasom je uključen u razvoj različitih bolesti.Studije su pokazale da Pseudomonas aeruginosa pokreće autofagiju u makrofagima kako bi se izbjegla ćelijska smrt, a ovaj proces ovisi o aktivaciji inflamasoma NLRP3 [53].Za N. caninum, aktivacija NLRP3 inflamasoma posredovana reaktivnim vrstama kiseonika ograničava njegovu replikaciju u domaćinu, što ga čini potencijalnom terapijskom metom [9].Utvrđeno je da paracoccidioides brasiliensis indukuje aktivaciju inflamasoma NLRP3 u dendritskim ćelijama dobijenim iz koštane srži miša, što rezultira oslobađanjem inflamatornog citokina IL-1β, koji igra ključnu ulogu u odbrani domaćina [10].Nekoliko vrsta Leishmania, uključujući L. amazonensis, L. major, L. braziliensis i L. infantum chagasi, aktiviraju NLRP3 i ASC zavisnu kaspazu-1 u makrofagima, kao i infekciju Leishmania.Replikacija parazita je pojačana kod miševa sa nedostatkom gena NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.Prijavljeno je da infekcija lajšmanijom izaziva aktivaciju inflamasoma NLRP3 u makrofagima, što ograničava intracelularnu replikaciju parazita.Stoga, Leishmania može inhibirati aktivaciju NLRP3 kao strategiju izbjegavanja.U in vivo studijama, inflamasom NLRP3 je doprinio eliminaciji Leishmanije, ali nije utjecao na tkiva [54].Suprotno tome, u studijama helmintijaze, aktivacija inflamasoma NLRP3 potisnula je zaštitni imunitet domaćina protiv gastrointestinalne helmintijaze [12].Šigela je jedna od glavnih bakterija koje izazivaju dijareju širom sveta.Ove bakterije mogu inducirati proizvodnju IL-1β kroz efluks K+ posredovanog receptorom P2X7, reaktivne vrste kisika, acidifikaciju lizozoma i oštećenje mitohondrija.NLRP3 inflamazom negativno reguliše fagocitozu i baktericidnu aktivnost makrofaga protiv Shigella [55].Studije plazmodija su pokazale da miševi sa nedostatkom AIM2, NLRP3 ili kaspaze-1 inficirani plazmodijumom proizvode visoke nivoe interferona tipa 1 i otporniji su na infekciju plazmodijumom [56].Međutim, uloga alfa-2 giardina i alfa-7.3 giardina u izazivanju patogene aktivacije upale NLRP3 kod miševa je nejasna.
U ovoj studiji, inhibicija inflamasoma NLRP3 od strane MCC950 smanjila je BW i povećala broj trofozoita u tečnosti za ispiranje crijeva kod miševa, što je rezultiralo ozbiljnijim patološkim promjenama u duodenalnom tkivu.Alfa-2 giardin i alfa-7.3 giardin aktiviraju NLRP3 inflamasom miša domaćina, povećavaju tjelesnu težinu miša, smanjuju broj trofozoita u tečnosti za ispiranje crijeva i ublažavaju patološke lezije duodenuma.Ovi rezultati sugeriraju da G. duodenalis može aktivirati inflamasom domaćina NLRP3 preko alfa-2 giardina i alfa-7,3 giardina, smanjujući patogenost G. duodenalis kod miševa.
Naši rezultati zajedno pokazuju da alfa-2 i alfa-7.3 giardini induciraju aktivaciju inflamasoma domaćina NLRP3 i smanjuju infektivnost G. duodenalis kod miševa.Stoga su ovi molekuli obećavajući ciljevi za prevenciju giardijaze.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: pregled.Nedavno je otkriveno da je Pat Inflamm alergičan na lijekove.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: pregled farmakoterapije.Stručno mišljenje farmaceuta.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, otpornost na lijekove i otkrivanje novih ciljeva.Inficira mete droga za poremećaj.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, itd. NLRP3 zapaljenske i inflamatorne bolesti.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Uloga inflamasoma u intestinalnoj upali i raku.Gastroenterologija.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonska i atipična aktivacija inflamasoma NLRP3 na raskršću imunološke tolerancije i upale crijeva.preimuni.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS posredovana aktivacija inflamasoma NLRP3 uključena je u odgovor na infekciju N. caninum.Vektor parazita.2020;13:449.